无机磷胁迫条件下的东海原甲藻差异表达基因的克隆与分析

摘要

东海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）是我国东海海域最主要的赤潮原因种之一。东海原甲藻赤潮以其高频率、大规模和持续时间长已引起了科研人员的广泛关注，但目前大多研究主要集中在生理生态、生活史及形态分类的探讨，而有关东海原甲藻赤潮生消机制的分子生物学研究却较少。溶解无机磷是东海原甲藻磷源的直接来源，然而对赤潮爆发地调查的资料显示，当赤潮爆发时海水中溶解无机磷含量并不高。故本课题通过模拟无机磷限制条件，来研究东海原甲藻响应无机磷胁迫的分子机制。
　　本课题利用抑制性差减杂交技术（suppression subtractive hybridization, SSH）构建了无机磷胁迫与非胁迫条件下东海原甲藻差异性表达基因的cDNA文库，拟在分子水平上探讨东海原甲藻响应无机磷胁迫的分子机制。分别以F/2-Si（对照组）和不添加无机磷元素的F/2-Si（实验组）培养基培养藻细胞，并于处理后的8 h、12 h、24 h和48 h收集藻细胞，提取总mRNA构建SSH-cDNA文库，把总mRNA反转录成cDNA加上接头后进行两轮差减杂交和两轮抑制性巢式PCR，最后将第二轮巢式PCR产物通过T–A克隆的方法与pMD?18–T Vector载体连接并转化到DH5α大肠杆菌中，随机挑选480个单克隆进行菌落PCR鉴定获得463个阳性克隆。进而通过商业量测序得到444个基因序列。用Contig Express软件出去引物及载体序列后在GenBank数据库中进行BlastX/BlastN比对分析，共鉴定出134个有效ESTs，根据参与的生物过程及分子功能，可将这些基因分成11大类，即：（1）细胞防卫和内稳态基因（3.73％）；（2）蛋白质代谢相关基因（20.15%）；（3）应激反应相关基因（5.22%）；（4）细胞骨架和结构蛋白（6.72%）；（5）DNA代谢和修复相关基因（0.75%）；（6）未分类或位置功能的基因（26.87%）；（7）参与信号通路基因（6.72%）；（8）细胞代谢相关基因（20.90%）；（9）转录和翻译调控相关基因（2.24%）；（10）磷代谢相关基因（3.00%）；（11）细胞周期相关基因（3.73%）。
　　为进一步验证所构建的差减文库是否代表差异表达的基因，分别选定与细胞代谢和应激反应相关的出5个基因，即NAD-dependent deacetylase、Extracellular sulfatase Sulf-1、Heat shock protein90、Heat shock protein70和Heat shock pr otein40作为考察对象，应用荧光定量PCR考察对照组和实验组中东海原甲藻基因的差异表达情况。结果显示：5个基因都有不同程度的差异性表达，其中除了H eat shock protein70以外其余4个基因经无机磷胁迫处理后表达量均上调，经配对T-检测NAD-dependent deacetylase、Extracellular sulfatase Sulf-1和Heat shock protein40处理前后表达量在统计学上有显著差异（P<0.05）。可见，本实验构建的SSH-cDNA文库基本代表差异表达的基因。

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第一章 绪论

1.1 赤潮概述

1.1.1 赤潮的定义和分类

1.1.2 赤潮的形成因素和危害

1.1.3 赤潮的预防和治理

1.2 东海原甲藻赤潮

1.2.1 光照强度和时间对东海原甲藻的影响

1.2.2 温度对东海原甲藻的影响

1.2.3 营养盐对东海原甲藻的影响

1.3 差异性表达基因的分子生物学研究方法

1.3.1 mRNA差异显示技术

1.3.2 代表性差异分析法

1.3.3 限制性差异显示技术（RFDD）

1.3.4 抑制性差减杂交技术

1.3.5 表达序列标签技术

1.4 无机磷限制条件下东海原甲藻相关研究进展

1.4.1国内研究进展

1.4.2国外研究进展

1.5 本课题研究的内容和意义

1.5.1研究内容

1.5.2 研究意义

第二章 东海原甲藻磷胁迫抑制性差减杂交文库的构建

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 实验藻种及培养

2.2.2 实验试剂

2.2.3 实验仪器

2.2.4 磷胁迫处理

2.2.5 总mRNA的提取和定量

2.2.6 Firststrand的反转录

2.2.7 LD–PCR

2.2.8 PCR产物的纯化回收

2.2.9 Rsa I 酶切消化

2.2.10 酶切ds cDNA的纯化

2.2.11 接头连接和连接效率的检测

2.2.12 第一轮差减杂交

2.2.13 第二轮差减杂交

2.2.14 第一轮巢式PCR扩增

2.2.15 第二轮巢式PCR扩增

2.2.16 T–A克隆

2.2.17 阳性克隆的菌落PCR鉴定

2.2.18 阳性克隆测序及序列分析

2.3 结果与讨论

2.3.1总mRNA的提取和定量

2.3.2 PCR循环数的优化

2.3.3 Rsa I酶切效率检测

2.3.4 接头连接效率的检测

2.3.5 两轮巢式PCR扩增差异表达基因

2.3.6 阳性克隆的检测

2.3.7 测序及生物信息学分析

2.4 本章小结

第三章 差异表达基因的荧光定量PCR实验确认

3.1 引言

3.2材料与方法

3.2.1 实验材料

3.2.2 实验试剂

3.2.3 实验仪器

3.2.4 磷胁迫处理

3.2.5 mRNA的提取和定量

3.2.6 总mRNA的反转录

3.2.7 特异性引物设计

3.2.8 荧光定量PCR反应

3.3 结果与讨论

3.3.1 总mRNA的提取和定量

3.3.2 引物的常规PCR验证

3.3.3 荧光定量PCR实验结果

3.4 本章小结

结论

参考文献

声明

致谢