肾脏远端小管钠氯共转运子维持水盐血压平衡及参与管球反馈的机制初探

摘要

目的： 机体维持水盐电解质和血压的平衡依赖于肾脏小球和小管结构的完整性和正常的管球反馈(tubuloglomerular feedback，TGF)。远端小管上的钠氯共转运子(NCC)是由SLC12A3基因编码的跨膜蛋白，它与近端小管髓攀升支粗段和致密斑的钠钾氯共转运子(NKCC2)、集合管的上皮钠通道(ENaC)共同组成了肾脏的水盐电解质平衡的重要防线，其中NKCC2和ENaC是致密斑和集合管管球反馈的重要感应子，而NCC与TGF的关系并不明确。SLC12A3基因失活突变导致NCC功能障碍即Gitelman综合征(GS)，是一种罕见的失盐性肾病，是研究NCC功能的天然疾病模型，但相关病理生理机制的研究不多，缺乏评价临床严重程度、可指导治疗的生物标志物和功能影像学方法。 本研究拟观察较大样本量的GS患者临床病理特点、生活质量和性别差异，比较NCC生理功能试验对GS的临床诊断价值;观察尿液PGE2及其代谢产物水平与临床的相关性，初步探索外泌体及功能核磁在GS中的应用价值。建立两种不同的盐敏感高血压小鼠模型：高盐-高醛固酮-低肾素模型(DS)和轻中度高尿酸导致的早期高血压模型(HUA)，探索NCC在高血压发生和肾损害中可能的作用，并在腺苷1型受体基因敲除(A1AR-/-)的模型中探讨管球反馈与NCC的相关性。 方法： 第一部分：先天NCC功能障碍的GS患者临床特点及生物影像标志物探索 1.纳入临床疑诊为失盐性肾病的患者，提取外周血DNA、PCR扩增后行SLC12A3基因测序进行基因诊断，作为诊断的金标准，采用氢氯噻嗪试验阻断NCC以评价其体内功能，分析比较该功能试验与经典的GS临床指标在诊断试验中的敏感性、特异性差异; 2.搜集GS患者临床资料，观察患者血压和水盐代谢的特点;留取患者血浆和24h尿标本ELISA法测定PGE2及其代谢产物PGEM的水平，分析其与临床资料及NCC功能的相关性;采用SF-36量表分析其生活质量，并与性别年龄匹配的健康受试者比较。比较GS患者以上资料的性别差异。收集女性患者的妊娠资料，观察妊娠期间血电解质水平的变化及妊娠相关并发症。 3.总结本中心肾活检的GS患者肾脏病理资料，免疫组化半定量分析肾脏皮质COX-2的表达与对照（肾小球轻微病变患者）的差异。提取尿液外泌体并进行形态、粒径和标志物的鉴定，免疫印迹法检测患者NCC、COX-2、COX-1蛋白表达水平。采用轴位IVIM（体内不相干运动成像）和DKI（弥散峰度成功能核磁）显像的方法，探索GS患者肾脏潜在的功能改变，分析其功能影像学参数与临床资料的相关性。 第二部分：盐敏感高血压小鼠模型的建立及NCC相关生理的改变 1.分别建立C57b1背景下的单肾切除-高盐-高醛固酮的盐敏感高血压(DS)小鼠模型（肾素抑制）和轻度高尿酸血症(HUA)诱导的早期盐敏感高血压（高肾素型）小鼠模型，尾夹法监测血压变化，观察血压及水盐代谢的变化;评价血压与饮食中盐含量的关系;病理染色观察肾脏病变特点、评价小管间质损害。 2.在两种模型中分别检测肾组织3种钠离子转运通道(NCC/NKCC-2/γENaC)蛋白和mRNA水平。定量上游的调控激酶SGK-1的蛋白表达，检测炎症焦亡信号caspase-1/IL18/IL1β及相关指标的异常。 3.放免法观察调节血压和出球小动脉收缩的肾素、血管紧张素Ⅱ和醛固酮水平，免疫组化进行球旁器肾素定位，免疫印迹法观察与管球反馈和入球动脉舒缩功能相关的腺苷受体表达水平。 第三部分：NCC在管球反馈缺失后对血压和水盐代谢的可能作用 1.在GS患者和非GS患者中进行速尿试验，计算试验前后的肌酐清除率以推测管球反馈的状态，比较GS患者和非GS患者肌酐清除率的变化，初步推测体内管球反馈的活化程度。 2.在管球反馈缺失的A1AR-/-小鼠中，分别观察DS模型和HUA模型的血压及水盐代谢变化，评价肾脏病变特点;免疫印迹法检测3种钠离子转运蛋白(NCC/NKCC-2/γENaC)和炎症焦亡信号caspase-1/IL18/IL1β的水平;比较A1AR敲除后其他类型腺苷受体的变化。 3.分离野生型和A1AR-/-小鼠肾小球的入球动脉，显微灌注观察不同尿酸水平对入球动脉的急性刺激作用;免疫组化半定量评估尿酸对野生型和A1AR-/-小鼠入球动脉的慢性重塑作用。 结果： 第一部分：先天NCC功能障碍GS患者临床特点及生物影像标志物 1.105例低血钾患者检测到SLC12A3基因突变，共携带69种突变，平均血压为110.0±12.4/72.1±9.8mmHg，并伴有不同程度的肾素、血管紧张素Ⅱ、醛固酮活化;氢氯噻嗪实验提示患者NCC不同程度受损。以基因诊断为金标准，氢氯噻嗪功能试验的敏感性和特异性分别为93.1％和88.9％，曲线下面积为0.989(95％CI0.961-1.000)，均优于低血镁和低尿钙单个指标或联用的临床诊断价值; 2.男性患者较女性发病早、血钾低、血压高、多尿更显著，但生活质量无差异。5例妊娠患者孕期前3月血钾水平较妊娠前显著下降，对症处理后，妊娠过程平稳、结局良好。男性尿PGE2及其代谢产物(PGEM)水平显著高于女性，且GS患者显著高于同性别的对照，并观察到升高的PGE2与更严重的NCC功能障碍（氢氯噻嗪试验）、代谢性碱中毒和电解质紊乱相关。肾皮质的COX-2蛋白表达显著低于对照。尿液外泌体蛋白定量检测到GS患者NCC表达显著减低，COX-2和COX-1的表达均增加。 3.GS患者肾脏病理以球旁器增生为主，可伴有肾小球肾炎和间质小管损伤。常规核磁显示GS患者肾脏无异常，功能成像中，弥散峰度成像的K值和D值均与血C1和HCO3-相关性良好，而IVIM的D值和DP值则与NCC体内功能损害程度相关。 第二部分：盐敏感高血压小鼠模型的建立及NCC相关生理的改变 1.成功建立高盐高醛固酮的DOCA盐敏感高血压小鼠，表现为收缩压和舒张压持续升高，并伴有尿量增加、尿钠排出量增加和尿渗透压下降;肾脏显著增大，较早(4w)出现小管间质损害和不同程度的间质纤维化，伴有NCC/NKCC-2的表达上调和Casepase-1/IL-1β的激活、COX2高表达。 2.氧嗪酸钾(250mg/kg/d)灌胃及0.1％尿酸水饲养成功诱导小鼠轻中度高尿酸血症，并引起血压轻度升高，不伴有尿酸肾病的间质小管改变。小鼠血压与饮食中盐浓度相关，符合盐敏感型高血压的特点，即血压随饮食中盐浓度升高而升高，但其肾组织NCC/NKCC-2/ENaC和炎症焦亡分子的表达量均无显著变化。 3.高盐高醛固酮小鼠肾素水平降低，管球反馈相关的A1AR受体无显著差异，A2aR显著降低;高尿酸盐敏感高血压模型中，球旁器肾素表达增加，肾素管球反馈相关的A1AR表达显著升高，而A2aR的表达降低，同时存在RAS系统和管球反馈活化。 第三部分：NCC在管球反馈缺失后对血压和水盐代谢的可能作用 1.速尿阻断致密斑NKCC2后，GS患者Ccr显著降低，降低的幅度超过NCC功能正常的非GS患者。 2.管球反馈缺失的A1AR-/-小鼠，建立DOCA高血压模型后，肾脏纤维化提前发生，伴随A1AR-/-时上调的A2bR恢复到野生型水平;单肾切除后，A1AR-/-小鼠血压轻度升高，NCC表达上调;高盐高醛固酮刺激不能进一步上调NCC，但可以通过上调NKCC-2促进水和盐的排泄，维持血压与WT-DS小鼠相似。 3.管球反馈缺失的高尿酸模型中血压恢复正常，入球动脉慢性重塑消失，伴有A2bR上调;急性尿酸直接刺激入球动脉收缩，并呈剂量依赖性。敲除A1AR后该效应消失，且扩张入球动脉。 结论： 1.先天性NCC功能障碍的GS患者表现为正常或低血压、低血钾，尿钾、钠、氯排泄增加，以基因诊断为金标准，采用NCC功能试验（氢氯噻嗪试验）临床诊断GS的敏感性和特异性均优于传统的临床诊断标准（低血镁和低尿钙）。 2.尿液PGE2水平升高有助于评价临床表现严重程度和NCC功能缺失程度，是潜在的治疗位点;外泌体COX-1和COX-2表达的增加可能是PGE2升高的机制，也可能与活化的管球反馈相关。功能核磁DKI和IVIM参数与NCC功能相关，需要进一步的研究证实。 3.低肾素的盐敏感高血压DS模型存在NCC和NKCC2表达上调，炎症可能为高滤过晚期的继发表现;管球反馈缺失后NCC可能与维持正常状态下的血压和电解质平衡相关，在醛固酮和高盐的进一步刺激下，NKCC-2表达增加。 4.在高尿酸诱导的盐敏感高血压中，NCC改变和炎症活化不突出，入球动脉的急性收缩和慢性重塑则是这一时期的高血压的重要发病机制，A1AR可能参与其中。

目录

英文缩略词表

摘要

前言

第一部分先天NCC功能障碍的GS患者临床特点及生物影像标志物探索

第一节Gitelman综合征患者NCC功能障碍及诊断试验

第二节Gitelman综合征患者临床特点及性别差异

第三节尿液外泌体和特殊影像学在Gitelman综合征中的应用价值

第二部分盐敏感高血压小鼠模型的建立和NCC相关生理的改变

第一节高盐-高醛固酮-低肾素盐敏感高血压小鼠模型的建立

第二节轻度高尿酸高血压小鼠(HUA)模型的建立和血压变化

第三节盐敏感高血压小鼠肾脏小管钠氯共转运子表达与炎症

第四节管球反馈相关的肾素和腺苷受体在高血压肾脏的表达

第三部分NCC在管球反馈缺失后对血压和水盐代谢的可能作用

第一节管球反馈对NCC及水盐平衡的影响

第二节A1AR参与轻度高尿酸盐敏感高血压小鼠入球动脉损伤

讨论

结论

参考文献

综述一 先天性NCC功能障碍：Gitelman综合征诊治进展

综述二 高尿酸损害入球动脉促进盐敏感高血压发生

个人简历

致谢

声明