H7N9大流行流感疫苗Vero细胞高产毒株的生物学特性及其制备工艺研究

摘要

H7N9流感病毒已在一些国家和地区传播[1,3]。人感染H7N9禽流感病毒后死亡率高达30％。研究发现，病毒对人呼吸道上皮细胞主要受体α-2，6-唾液酸的亲和力不断增加[4,5]，且部分毒株对现行的抗病毒药物已经产生了耐药性[4,6-8]，WHO将H7N9禽流感病毒列为潜在的大流行流感病毒[7]。因此，研制人用H7N9禽流感疫苗具有重要战略意义。 目前国内流感疫苗生产用病毒种子批均是从国外获得，如果将高致病禽流感病毒H7N9改造成疫苗株再返回国内用于疫苗生产，则很可能会错过防控流感大流行的最佳时机。此外，大多数现行流感疫苗基本是采用鸡胚生产，鸡胚供应周期长，尤其是当高致病性禽流感爆发时，种鸡有可能感染病毒死亡进而加剧鸡胚供应不足，造成疫苗生产困难。与鸡胚相比，非洲绿源猴肾细胞(Vero)可以采用发酵罐培养，易实现大规模生产和质量控制且具有较高安全性，适合用于疫苗生产。但流感病毒流行株在Vero细胞上产量不稳定，阻碍Vero细胞流感疫苗的研发[9,10]。因此，开展研究，通过解决流感病毒在Vero细胞上产量不稳定问题研发出具有自主知识产权的Vero细胞H7N9大流行流感疫苗。 首先，以A/Kunming/1/2005Va(H3N2)（以下简称H3N2Va）[11,12]作为供体株提供控制Vero细胞高产特性的PB2、PB1、PA、NP、M、NS六个内部基因，与A/Shanghai/2/2013(H7N9)(以下简称H7N9)流感病毒的HA、NA表面抗原基因进行6+2组合共同转染293T细胞，拯救出病毒A/Shanghai/2/2013(H7N9)Va(以下简称H7N9Va)。证明了重配病毒具有Vero细胞高产特性，在Vero细胞上连续传代15代，血凝效价稳定在1∶128，感染性滴度稳定在7.0LgTCID50/mL。此外，也证明了重配病毒具有较高生物安全性:(1)连续传代过程中病毒表面抗原基因未突变，氨基酸序列未发生替换。(2)较高感染性滴度的活病毒接种SPF鸡胚100％存活。(3)5.5LgTCID50/mL病毒感染小鼠100％存活，感染3天后检测肺脏中病毒载量为5.5LgTCID50/g组织，与WHO疫苗推荐毒株对照组的组织病毒载量间差异无统计学意义(P＞0.05)。小鼠肺脏中促炎症因子含量较低，肺部炎症反应轻微。还证明了灭活病毒在小鼠模型上具有较好免疫原性。 其次，优化了Vero细胞培养H7N9重配病毒的条件为:病毒接种量0.01MOI，TPCK-胰蛋白酶含量为1μg/mL。H7N9Va病毒收获液血凝效价为1∶160-1∶256，感染性滴度维持在7.0LgTCID50/mL以上。同时，结合使用过滤澄清、超滤浓缩、凝胶层析和离子交换层析纯化病毒收获液。结果显示，病毒浓缩液经Sepharose4FF纯化后再经Capto Q层析纯化的病毒回收率较高可达70％，Vero细胞宿主残余DNA低于100pg/剂。纯化病毒液各指标均达到《中国药典》三部的要求。纯化病毒制备成全病毒灭活苗后免疫小鼠，小鼠获得了良好免疫保护效果，保护效果呈剂量依赖型。 最后，通过加入佐剂AS03和BW006降低H7N9全病毒灭活疫苗的有效剂量。采用AS03佐剂可使疫苗有效剂量降低到3.75μg HA，仅为不加佐剂剂量的1/8。 总之，反向重配出具有Vero细胞高产特性并同时具有较高生物安全性的疫苗备选株H7N9Va。通过优化H7N9Va毒株的培养条件，探索其后处理纯化方案，并使用佐剂将H7N9Va全病毒灭活疫苗的有效剂量降低到原剂量的1/8。在流感大流行时，可以确保在短期内生产更多满足应急需要的疫苗，对流感大流行具有极其重要意义。

目录

摘要

前言

第一章反向遗传学重配获得H7N9流感病毒Vero细胞高产株

引言

第一节 H7N9的表面抗原基因与A／Kunming／1／2005Va(H3N2)母本株内部基因的遗传重配(6+2遗传重配)

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

讨论与小结

第二节流感病毒Vero细胞高产重配株(H7N9Va)生物学特性评价

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

讨论与小结

第三节流感病毒Vero细胞高产重配株(H7N9Va)安全性及免疫原性评价

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

讨论与小结

第二章Vero细胞培养H7N9Va及Vero细胞H7N9大流行流感灭活疫苗的制备

引言

第一节 Vero细胞培养H7N9Va条件优化

1．实验材料

2．实验方法

3实验结果

讨论与小结

第二节H7N9Va后处理纯化工艺探索

2．实验方法

3．实验结果

讨论与小结

第三节Vero细胞H7N9大流行流感疫苗免疫效果研究

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

讨论与小结

第三章佐剂降低Vero细胞H7N9大流行流感疫苗剂量的研究

引言

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

讨论与小结

本研究创新点及全文内容总结

参考文献

附录

致谢

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