长链非编码RNA与免疫相关基因在食管鳞癌发生发展中的功能机制与临床意义研究

摘要

本文从以下两部分进行了阐述： 第一部分 长链非编码RNA NMR在食管鳞癌中的功能机制和临床意义研究 食管癌是世界范围内的常见恶性肿瘤，其发病率居第八位，在恶性肿瘤相关死亡率居第六位。我国90％以上的食管癌患者病理类型为鳞状细胞癌，中国是食管鳞癌的高发地之一。大多数食管鳞癌患者在确诊时已为晚期，常伴有淋巴结转移或者远处转移，缺乏有效的治疗手段，尤其是靶向药物。更重要的是，食管鳞癌的机制研究仍有待深入探索，尤其是在肿瘤发生发展与药物敏感性等领域。因此，通过食管鳞癌的机制研究，以期发现有效的标志物和治疗靶点具有重要的意义。 长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一类分子长度大于200个碱基且不编码蛋白质的RNA分子。近年来，lncRNA在恶性肿瘤中的研究备受关注，越来越多的lncRNA在恶性肿瘤中异常表达并参与肿瘤的发生发展。LncRNA在食管鳞癌中的功能与机制研究尚不深入，对食管鳞癌进行lncRNA表达谱的鉴定和功能机制研究，有利于发现可以作为肿瘤诊断或预后的标志物分子和潜在的治疗靶点。 在本研究中，本课题组前期通过对食管鳞癌高通量组学数据分析鉴定出一个全新的食管鳞癌有关lncRNA，并结合后续的功能机制特征将其命名为lncRNA NMR(NSUN2 Methylated long noncoding RNA)。 在本课题组前期119对食管鳞癌组织和配对正常食管组织lncRNA表达谱芯片数据中，lncRNANMR在肿瘤组织中的表达显著高于在癌旁正常组织中的表达，并且与食管鳞癌患者的预后显著相关，高表达lncRNA NMR提示较差的总体生存。该结果在本课题组的表达谱芯片和TCGA数据库中头颈鳞癌RNA测序数据有着较为一致的结果，并且在独立的83例食管鳞癌患者样本中得到验证。细胞功能实验表明，lncRNANMR在食管鳞癌细胞中发挥癌基因的作用，与食管鳞癌细胞的迁移侵袭和对化疗药物的敏感性有关。敲降lncRNA NMR的表达能够显著抑制食管鳞癌细胞的迁移与侵袭，促进顺铂诱导的细胞凋亡，而过表达lncRNA NMR能够显著促进食管鳞癌细胞的迁移与侵袭，抑制顺铂诱导的细胞凋亡，降低对顺铂和紫杉醇的敏感性。在机制方面，食管鳞癌中上调的lncRNANMR可能与NF-κB通路相关，NF-κB作为转录因子，在IL-1β和TNF-α的刺激下被激活进而结合到lncRNA NMR的启动子区域进而促进lncRNA NMR的转录表达;同时，lncRNANMR能够直接结合NSUN2蛋白并被其甲基化，同时可能竞争性抑制mRNA的甲基化水平;此外，lncRNA NMR能够结合染色质调节因子BPTF调控基因转录，通过激活ERK通路上调MMP3和MMP10基因的表达。 综上所述，该研究首次揭示了一个全新的lncRNA NMR在食管鳞癌中作为癌基因的具体功能和作用机制。基于lncRNA NMR与食管鳞癌临床的高度相关性并在其进展中发挥重要作用，lncRNANMR是食管鳞癌转移和预后的潜在标志物，同时有可能成为食管鳞癌新的治疗靶点。 第二部分 免疫相关基因在食管鳞癌中临床意义研究 免疫治疗是当前肿瘤治疗中最受关注和发展最为迅速的领域。针对PD1、PD-L1和CTLA4等靶点免疫检查点抑制剂在部分实体肿瘤中取得了令人瞩目的成绩，但在其它肿瘤中尚未研究或者效果不佳。肿瘤微环境中的免疫失调，通常被认为是促进肿瘤进展的关键因素。随着肿瘤免疫越来越受关注，对肿瘤细胞与肿瘤微环境中的免疫系统交互作用的研究更加深入，通过高通量技术检测和反映肿瘤微环境中免疫状态能够为肿瘤治疗提供有效的标志物或潜在的新治疗靶点。食管鳞癌缺乏有效的靶向治疗药物，总体生存预后很差。因此，系统地分析食管鳞癌微环境中免疫特征谱十分必要，能够为食管鳞癌的免疫治疗提供依据。 在本研究中，我们从119例食管鳞癌组织和配对食管正常组织的mRNA表达谱芯片中提取了708个免疫相关基因的表达数据，并将708个基因分为5个大类。癌与癌旁差异表达分析显示共有186个基因显著异常表达，其中99个免疫相关基因显著上调，87个免疫相关基因显著下调。我们用Human Protein Atlas数据库中的免疫组化数据对显著下调的基因SPINK5，IL1RN和显著上调的基因SPP1，PLAU进行了验证，结果与芯片数据相一致。这些异常表达的基因显著富集于包括T细胞活化和NF-κB通路等重要免疫功能或相关信号通路，提示肿瘤微环境中免疫系统参与食管鳞癌的发生发展，并可能影响食管鳞癌患者的预后。 在生存分析中，9个基因(ABL1、ATF2、ATG5、C6、CD38、HMGB1、ICOSLG、IL12RB2和PLAU)显著与预后相关。其中，ABL1，CD38和ICOSLG三个基因成为独立的预后因子，构建的三基因预后预测模型能够很好的预测食管鳞癌患者的总体生存。我们同样对生存分析的结果进行了免疫组化验证，ABL1，CD38和ICOSLG在独立验证的110例食管鳞癌患者中，均与患者的总体生存显著相关;此外，CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞也与患者的总体生存显著相关，并且三基因预测模型联合CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞能够更好的预测食管鳞癌患者的预后。 综上所述，在食管鳞癌中，之前仅仅有少量的关于肿瘤浸润淋巴细胞的研究报道，本研究首次系统全面地分析了免疫相关基因与食管鳞癌的临床相关性。本研究报道了食管鳞癌中异常表达的免疫相关基因，并构建了预后预测模型。这些异常表达或与临床预后显著相关的免疫相关基因，为食管鳞癌的免疫治疗提供了新的候选靶点或者联合治疗靶点。

目录

表索引

图索引

第一部分长链非编码RNA NMR在食管鳞癌中的功能机制和临床意义研究

中英文缩略词表

摘要

前言

实验材料

一、主要实验试剂

二、主要仪器设备

三、溶液配制

实验方法

二、食管鳞癌细胞系与永生化正常食管上皮细胞

三、组织及细胞系中基因组DNA和总RNA的提取

四、细胞质与细胞核提取物的制备

五、PCR检测mRNA的表达水平

六、PCR产物胶回收

七、载体质粒克隆

八、质粒提取

九、Western Blot检测蛋白的表达水平

十、快速cDNA末端扩增

十一、Northern Blot

十二、RNA-FISH

十三、DNA电泳迁移事实验(DNA-EMSA)

十四、染色质免疫沉淀(ChIP)

十五、双荧光素酶报告基因

十六、RNA-pulldown

十七、RNA m5C甲基化检测

十八、RNA测序(RNA-Seq)

十九、细胞功能实验

二十、统计学分析

实验结果

一、LncRNA NMR在食管鳞癌组织中高表达并提示不良预后

二、LncRNA NMR的分子特征

三、食管鳞癌细胞系的选择与构建

四、LncRNA NMR能够促进食管鳞癌细胞的迁移和侵袭

五、LncRNA NMR能够抑制顺铂和紫杉酵诱导的细胞凋亡

六、LncRNA NMR的转录受NF-κB的调控

七、LncRNA NMR能够直接结合NSUN2和BPTF

八、LncRNA NMR通过激活ERK通路上调MMP3和MMP10的表达

讨论

小结

参考文献

第二部分 免疫相关基因在食管鳞癌中临床意义研究

中英文缩略词表

摘要

前言

实验材料

二、主要仪器设备

实验方法

四、免疫组织化学分析

五、统计学分析

实验结果

一、食管鳞癌中差异表达的免疫相关基因

二、食管鳞癌中免疫相关基因的预后价值分析

三、免疫组化验证差异表达免疫相关基因

四、免疫组化验证预后相关免疫相关基因

五、预后相关因子与临床病理之间的相关性分析

讨论

小结

参考文献

附表

基金资助

在学期间发表论文

文献综述 长链非编码RNA在头颈癌中的研究进展

致谢

个人简历

声明