激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞功能改变及转录组差异的研究

摘要

研究背景： 股骨头坏死(Osteonecrosis of Femoral Head，ONFH)是以股骨头血供受损，骨细胞及骨髓成份死亡，继而导致股骨头结构改变、股骨头塌陷、关节功能障碍为特征的骨科常见疾病，高发于青壮年。因股骨头坏死塌陷而行全髋关节置换术的患者占全部全髋关节置换总数的30％，为家庭和社会带来了沉重的经济负担。在中国，激素的应用仍为股骨头坏死发生的首要危险因素，激素性股骨头坏死约占股骨头坏死总数的35％。目前，激素性股骨头坏死的发病机制仍不明确，因而限制了对于激素性股骨头坏死早期诊断方法和干预手段的发展。 研究表明，骨髓间充质干细胞(Bone marrow Mesenchymal Stem Cells，BMSC)的数量减少及细胞行为的改变与激素性股骨头坏死的发生发展密切相关。然而，对于激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞的生物学特性改变存在争议。在前期研究中，课题组在激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞中发现了差异表达的miRNA。然而，miRNA的差异表达不能完全阐释激素性股骨头坏死的发生机制，多种非编码RNA可以在转录组层面进行相互作用从而调节基因表达。因此，全面的理解激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞中的转录组差异表达可能为进一步的探索其发生机制提供条件。 研究目的： 1.比较激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞与正常对照之间的细胞功能差异。 2.利用高通量测序及生物信息学分析技术，在转录组层面研究激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞差异基因表达。 3.在BMSC探索差异lncRNA：lncRNA-RP11-154D6、lncRNA-RP3-331H24.6和lncRNA-RP3-331H24.7对BMSC功能影响 4.初步探索lncRNA-RP11-154D6、lncRNA-RP3-331H24.6和lncRNA-RP3-331H24.7与miR-30a-5p和miR-30c-5p的相互作用机制。 研究方法： 1.骨髓间充质干细胞的分离、培养：从7例激素性股骨头坏死患者和7例正常对照体内取骨髓组织，密度梯度离心法分离培养骨髓间充质干细胞并传代，流式细胞术对细胞表型进行验证。 2.通过CCK-8和Edu增殖实验、AnnexinⅤ-PI凋亡实验比较两组骨髓间充质干细胞的增殖能力和凋亡率的差异;诱导骨髓间充质干细胞向成骨、成脂方向分化，通过碱性磷酸酶染色、茜素红染色、油红O染色以及成骨、成脂标记物的表达情况比较两组之间的分化能力差异。 3.通过高通量全基因组测序对两组中各3例骨髓间充质干细胞进行全转录组测序，得到激素性股骨头坏死过程中差异表达的mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA。 4.通过生物信息学手段对差异基因进行功能富集分析，并对lncRNA和mRNA、circRNA和miRNA进行共表达分析，揭示其相互作用机制。 5.在正常BMSC中过表达/低表达过表达lncRNA-RP11-154D6、lncRNA-RP3-331H24.6和lncRNA-RP3-331H24.7，观察其在BMSC中与miR-30a-5p和miR-30c-5p的相互作用以及对于BMSC功能的影响。 研究结果： 1.分离骨髓间充质干细胞，表面抗原鉴定显示CD29，CD44，CD73，CD90和CD105呈阳性表达，而CD31和CD45呈阴性表达。 2.激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞培养24h、48h和72h后，CCK-8吸光度值均显著低于正常对照(24h：0.35±0.02vs0.39±0.04，P=0.02;48h：0.54±0.06vs0.68±0.08,P=0.004;72h：0.92±0.04vs1.15±0.08,P=0.0006)。培养24h后其Edu阳性率为26.67％±10.85％，显著低于正常对照的66.03％±8.71％(p=0.0021)，提示激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞增殖能力降低。而其总凋亡率为24.64±3.68％，较正常对照组显著增高（17.48±4.05％，p=0.0041）。 3.通过碱性磷酸酶染色、茜素红染色、油红O染色以及成骨(ALP,OCN，RUNX2和BSP)、成脂标记物（PPARγ，LPL和FABP4）的检测，发现激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞成骨分化能力减弱，成脂分化能力增强。 4.在激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞中发现3114个mRNA、572个lncRNA、224个miRNA和231个circRNA差异表达并构建共表达网络。 5.lncRNA-RP11-154D6与miR-30a-5p和miR-30c-5p的表达趋势呈正相关，且lncRNA-RP11-154D6可以抑制BMSC增殖并促进凋亡;lncRNA-RP3-331H24.6和lncRNA-RP3-331H24.7能够促进BMSC增殖并抑制凋亡过程，且其表达趋势与miR-30a-5p和miR-30c-5p呈负相关。 研究结论： 1.激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞增殖、凋亡及分化能力均较正常细胞改变，可能是导致激素性股骨头坏死发生的原因。 2.激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞中存在异常表达的mRNA、miRNA、lncRNA及circRNA，这些异常表达的基因可能通过相互作用影响细胞功能，从而调控激素性股骨头坏死的发生发展。 3.lncRNA-RP11-154D6、lncRNA-RP3-331H24.6和lncRNA-RP3-331H24.7可能通过与miR-30a-5p和miR-30c-5p的相互作用，调控BMSC增殖和凋亡过程。

目录

缩略词表

摘要

前言

第一部分 激素性股骨头坏死中骨髓间充质干细胞功能变化的研究

材料与方法

实验结果

讨论

小结

第二部分 激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞转录组差异的初步研究

材料与方法

实验结果

讨论

小结

结论

参考文献

文献综述 环状RNA(circRNA)在骨与关节疾病中的研究进展

附录

致谢

声明