虎眼万年青属糖基转移酶的挖掘及其在糖苷多样性中的应用

摘要

天然产物的糖基化修饰在动物、植物及微生物中广泛存在。经糖基化修饰后的小分子化合物往往具有较好的药理活性、较高的生物利用度及较小的毒副作用。在生物体中，糖基化过程由具有不同功能的糖基转移酶来完成。通过深入研究各种糖基转移酶的功能及性质，突出其优点从而实现以合成生物学技术制备天然糖苷产物。 本文围绕从虎眼万年青属(Ornithogalum)植物中克隆得到的糖基转移酶基因OcUGT1和OsUGT1展开探索，对其进行功能鉴定、酶学特征分析等研究。发现OcUGT1不仅可以利用UDP-糖实现经典的糖基化反应，同时还能在不添加UDP或UDP-糖的条件下利用廉价糖苷发生转糖反应实现糖基化。此外，OcUGT1还可以催化三种可逆反应，即UDP-糖合成反应、糖基或苷元交换反应和水解反应。OsUGT1作为橙酮糖基转移酶，可以特异性地催化硫磺菊素发生糖基化反应，且同样具有转糖及水解活性。 该结果的发现表明OcUGT1和OsUGT1兼具糖基转移酶及糖苷酶双重活性，拓宽了糖基转移酶的应用前景，且其多种活性的验证为后续利用合成生物学技术实现小分子糖苷的规模化制备打下坚实的基础。 1.虎眼万年青Ornithogalum caudatum中多功能黄酮糖基转移酶OcUGT1的分离及功能鉴定 糖基转移酶作为一种双向生物催化剂可以催化多种小分子化合物的糖基化反应。然而在糖苷合成的过程中，糖基转移酶的应用往往受限于其需要昂贵的NDP-糖或NDP作为底物参与反应。在此，为了鉴定参与天然产物糖基化过程的糖基转移酶，从虎眼万年青中得到了黄酮糖基转移酶OcUGT1，它可以在不需要额外添加NDP-糖或NDP的情况下，利用糖苷实现转糖反应。此外，OcUGT1还展现出了额外五种功能，包括经典的糖基化反应和三种可逆反应，即NDP-糖合成反应、糖交换和苷元交换反应，以及水解反应。以上结果表明OcUGT1兼具糖基转移酶和糖苷酶活性。 2.通过OcUGT1催化糖基化和转糖反应生物合成7，8-二羟基黄酮糖苷 OcUGT1可以通过糖基化和转糖反应催化7，8-二羟基黄酮的C-8位发生糖基化。OcUGT1催化7，8-二羟基黄酮糖基化反应形成两个单糖苷，7，8-二羟基黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷和7，8-二羟基黄酮-8-O-β-D-葡萄糖苷以及一个二糖苷7，8-二羟基黄酮-7，8-O-β-D-二葡萄糖苷。通过分子间转糖反应，同样可以催化形成两个单糖苷。 3.OcUGT1催化睾酮与备选供体底物间的糖基化反应 睾酮-17-O-β-D-葡萄糖苷是睾酮-17-O-β-D-葡萄糖-3'-乙酰这个具有抗肿瘤活性化合物的前体物质。已利用糖基转移酶催化睾酮和UDP-葡萄糖发生反应，通过生物合成方式获得睾酮糖苷。然而在此过程中对于昂贵的UDP-葡萄糖较低的利用度往往限制了乙酰化睾酮糖苷成药性的研究。因此，发现可替换的廉价糖基供体之于睾酮糖苷生物合成过程的研究是极为迫切的。虎眼万年青来源的黄酮糖基转移酶OcUGT1作为一种牛物催化剂，可以催化睾酮与多种糖基供体间发生反应。实验结果表明，OcUGT1可以催化睾酮与UDP-葡萄糖经糖基化反应形成睾酮-17-O-β-D-葡萄糖苷和一个二糖苷。同时，睾酮与邻硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷及对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷通过转糖反应，也可得到相应糖苷产物。 4.桑多斯虎眼万年青Ornithogalum saundersiae中橙酮糖基转移酶的发掘及功能鉴定 橙酮糖苷具有多种生物活性。然而关于糖基转移酶催化橙酮糖基化反应的报道却很有限。从桑多斯虎眼万年青中分离得到的OsUGT1，通过保守结构域分析表明OsUGT1属于黄酮糖基转移酶的进化分支，但却并未与已知的黄酮糖基转移酶成簇，这也暗示着其作为一个新的分支催化橙酮类化合物发生糖基化反应。体外酶催化反应结果表明OsUGT1可以催化硫磺菊素形成相应单糖苷，同时其还可以催化黄酮类化合物的糖基化反应。此外，OsUGT1还具有糖苷酶活性，具有分子间转糖和水解功能。

目录

英文缩略词表

摘要

第一章前言

1．1概述

1．2黄酮糖基转移酶研究进展

1．3糖基转移酶催化形成黄酮糖苷

1．4糖基化反应中的糖基供体

1．5黄酮作为糖基受体及其糖基化位点

1．6黄酮糖苷的药理活性

1．7总结与展望

第二章实验材料与方法

2．1主要仪器设备及生产厂家

2．2实验材料

2．2．1标准品及常用试剂

2．2．2常见溶液配方

2．3植物材料

2．4抗生素的配制

2．5试剂盒及酶等生化试剂

2．6菌株及质粒

2．7常用实验方法

2．7．1感受态细胞制备方法(CaCl2法)

2．7．2克隆载体连接

2．7．3大肠杆菌转化

2．7．4重组子的筛选

2．7．5重组蛋白的诱导表达

2．7．7蛋白染色——银染法、考马斯亮蓝染色法

2．7．8蛋白纯化及超滤

2．7．9 Western-Blot(蛋白免疫印迹)方法

第三章虎眼万年青(Ornithogalum caudatum)多功能糖基转移酶的挖掘及功能鉴定

3．1实验方法

3．1．2虎眼万年青cDNA合成及OcUGT1基因克隆

3．1．3生物信息学分析

3．1．4表达载体构建

3．1．5蛋白诱导表达及检测

3．1．6 OcUGT1的纯化及超滤

3．1．7蛋白定量

3．1．8 OcUGT1功能鉴定

3．1．9 OcUGT1植物组织表达水平分析

3．1．10所用引物、菌株及质粒

3．2实验结果

3．2．2 OcUGT1生物信息学分析

3．2．3 OcUGT1分子进化树的构建及多序列比对结果

3．2．4 OcUGT1表达载体构建及异源表达、纯化

3．2．5 OcUGT1糖基化功能及相关酶学参数的测定

3．2．6 OcUGT1糖基化可逆反应功能鉴定

3．2．7 OcUGT1水解功能鉴定及相关酶学参数测定

3．2．8 OcUGT1转糖功能鉴定及相关酶学参数测定

3．2．10本章总结

附录

第四章利用OcUGT1催化糖基化及转糖反应生物合成7，8-二羟基黄酮苷

4．1实验方法

4．2实验结果

4．2．1通过OcUGT1糖基化及转糖功能催化合成7，8-二羟基黄酮苷

附录

第五章睾酮糖苷的生物合成及糖基供体筛选

5．1实验方法

5．2实验结果

5．2．1通过OcUGT1糖基化及转糖功能催化合成睾酮糖苷

附录

第六章桑多斯虎眼万年青(Ornithogalum saundersiae)中橙酮糖基转移酶的分离及功能鉴定

6．1实验方法

6．2实验结果

6．2．3 OsUGT1异源表达及纯化

6．2．4 OsUGT1糖基化功能鉴定及酶学参数测定

6．2．5 OsUGT1转糖及水解功能鉴定

6．2．6本章总结

附录

第七章全文总结与创新点

参考文献

致谢

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