Wnt5a参与开胸术后慢性疼痛形成机制的研究

摘要

本文主要从以下几方面展开论述： 第一部分 Wnt5a通过促炎机制参与开胸术后慢性疼痛形成 目的： 在术后慢性疼痛中，开胸术后慢性疼痛(chronic post-thoracotomy pain，CPTP)发生率仅次于截肢术后慢性疼痛发生率，且机制未明。近年研究发现，脊髓和背根神经节中Wnts参与神经病理性疼痛和炎性疼痛的产生，而后两者被认为是CPTP主要构成组分;此外，在炎症性疾病及离体免疫细胞的研究表明，Wnts参与调控炎症反应，而外周和中枢神经系统中发生的炎症反应对疼痛的外周和中枢敏化作用十分关键。鉴于此，本实验拟通过建立大鼠CPTP模型，首先证明Wnts与CPTP之间的相关性;进一步，研究与CPTP发生可能相关的外周和中枢神经炎症机制，以及CPTP中Wnts对炎症的调节作用。 方法： 参考Buvanendran方法建立大鼠CPTP模型，将大鼠分为Na(i)ve、Sham和Model组，采用机械刺激伤害感受阈值（mechanical withdrawal threshold，MWT）测定、冷痛阈值测定及痛觉过敏定性评估(qualitative hyperalgesia profile，QHP)三种方法评估疼痛行为。首先在术后21 d提取各组脊髓背角(spinal cord dorsal horn，SDH)总RNA和背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)总RNA，用RT-PCR法检测Wnt通路相关信号分子mRNA表达变化，主要包括配体、胞膜受体、胞内激酶及炎症信号相关分子等。然后再用免疫荧光对术后21 d SDH和DRG中相关目的蛋白进行定位，并用Western blot进行蛋白定量检测，用ELISA法连续监测术后血液中促炎因子随时间的变化趋势。随后在术后早期（术后7、8、9d）分别连续鞘注不同Wnts抑制剂，观察其对疼痛行为的影响，及对中枢和外周神经炎症、全身炎症的影响。 结果： Model组在术后21 d根据MWT大小会出现两种疼痛情况，据此分为CPTP组(MWT≤4 g)和non-CPTP组(MWT＞4 g)，两组在同一天的QHP分级分布比较从术后5d到21 d差异均有统计学意义。与Sham组和non-CPTP组相比，CPTP组SDH中增加的mRNA只有Wnt5b，DRG中增加的mRNA有Wnt5a、Wnt5b、Wnt11、Ror2和PKCβ2。免疫荧光直观显示，Wnt3a和Wnt5a在SDH和DRG中均主要分布于神经元细胞质中，当CPTP发生时，SDH中Wnt3a和Wnt5a的表达增加主要集中于神经轴突，而DRG中二者表达增加主要发生在神经元细胞质。Western blot显示，CPTP发生时，SDH和DRG中，Wnt3a、Wnt5a、β-catenin、GFAP和TLR4蛋白表达增加;同时，SDH中IL-1β和IL-6蛋白表达增加，DRG中IL-1β和NF-κB蛋白表达增加，术后7～21 d血清中IL-1β和IL-6表达增加。术后早期鞘内注射Wnt5a特异性拮抗剂Box5可以增加术后9～21 d MWT、改善术后21 d QHP分级分布，降低SDH和DRG中TLR4和GFAP蛋白表达，并降低DRG和外周血中IL-1β水平，但鞘内注射Wnts产生抑制剂IWP-2并无此效应。 结论： 开胸术后早期鞘内抑制Wnt5a活性可以通过降低中枢和外周神经系统炎症反应减轻术后慢性疼痛;同时，Wnt5a还可以调节SDH和DRG中TLR4表达。 第二部分 Wnt5a通过调节非经典Wnt通路及神经再生参与开胸术后慢性疼痛形成 目的： 作为在组织再生及炎症反应中起重要作用的Wnts蛋白，近年被证实在疼痛产生中扮演一定角色。我们第一部分研究显示，鞘内干预Wnt5a可以通过抗炎作用减轻大鼠开胸术后慢性疼痛(chronic post-thoracotomy pain，CPTP)，但干预Wnts生成却无此效果。鉴于Wnt5a常通过激活非经典Wnt通路发挥作用，本部分研究进一步探讨CPTP发生时，背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)内Wnt5a对非经典Wnt通路的调控作用。同时，因神经再生及交感芽生与疼痛持续密切相关，而离体细胞中已有研究证实二者可被Wnt5a调控，我们还将研究CPTP发生时，DRG内Wnt5a对神经再生及交感芽生的调节作用。另外，针对术后不同时段DRG内激活的信号可能并不相同，我们还检测了上述目的蛋白的时间表达趋势，并通过在不同时段干预Wnt5a，观察各时段Wnt5a对其调控作用的差异。 方法： 用免疫荧光共染对Wnt5a在DRG内小神经元上的分布进行定位。分别于术后7、14、21 d收集DRG进行Western blot检测，比较Wnt5a配体、膜受体Ror2、胞内信号分子pCaMKⅡ、CaMKⅡ、pERK/ERK、RhoA、GAP43（神经再生指标）、TH（交感芽生指标）及GFAP（星形胶质细胞活化指标）随时间变化的蛋白表达趋势。随后分别在术前(术前1d，术前30 min，术后1d)、术后早期(术后7、8、9d)及术后晚期（术后14、15、16d）连续3次鞘注Wnt5a特异性拮抗剂Box5对Wnt5a活性进行干预，观察其对机械痛阈值的影响，并在术后21 d统一取材，观察其对上述各蛋白表达的影响。 结果： CPTP时DRG内Wnt5a，Ror2及GFAP蛋白表达在术后7d到21 d均增加，而非经典Wnt通路中的pCaMKⅡ，CaMKⅡ，pERK/ERK，RhoA及GAP43和TH等蛋白均到术后14d甚至21d才明显增加。术前及术后早期鞘注干预Wnt5a能明显增加机械痛阈值，而术后晚期干预虽也能增加机械痛阈值，但机械痛阈值增加的峰值及持续时间均不及前者。另外，术前及术后早期干预Wnt5a能明显降低Wnt5a，Ror2，非经典Wnt通路，GAP43，TH及GFAP的活化。而术后晚期干预仅对GAP43表达有降低作用。 结论： 以上研究表明，开胸术后早期干预Wnt5a的镇痛效果强于术后晚期;术后早期DRG内激活的Wnt5a通过作用于Ror2受体，调控非经典Wnt通路、神经再生及交感芽生参与CPTP形成;而术后晚期DRG内增加的Wnt5a通过调节神经再生参与CPTP形成;针对Wnt5a的各干预措施宜在术后早期开展。

目录

第一部分Wnt5a通过促炎机制参与开胸术后慢性疼痛形成

摘要

前言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

结论

第二部分Wnt5a通过调节非经典Wnt通路及神经再生参与开胸术后慢性疼痛形成

摘要

前言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

缩略词表

文献综述 应用牵开器相关的术后慢性疼痛机制研究进展

博士在读期间公开发表的文章及获得的奖励

致谢

声明