基于活性氧响应的聚合物纳米疫苗递送系统的构建及评价

摘要

疫苗(Vaccine)是用于预防传染病的抗原制剂，在预防和治疗重大传染病以及保护人类免受侵害的过程中发挥着极为重要的作用。重组抗原或多肽的亚单位疫苗已逐渐成为一种新型的疫苗。然而，诱导有效的免疫反应仍然是重大挑战。纳米颗粒抗原传递系统被认为是一种潜在的载体系统，可以提高亚单位疫苗效力。 感染病毒等抗原后会引起淋巴细胞活性氧(Reactive oxygen species，ROS)升高，过高浓度会促使淋巴细胞损伤凋亡;再如过量的ROS产生，特别是过氧化氢产生过剩从而引起炎症、触发细胞凋亡和组织氧化损伤。利用过量的ROS引起慢性炎症如炎症反应、癌症以及炎症后持续释放ROS浓度升高等疾病特点，设计ROS响应的聚合物材料制成纳米载体，降低病灶部位ROS浓度，同时实现靶向递送疫苗。因此，本论文采用简单的两步法合成了两亲性聚合物材料3s-PLGA-PO-PEG，该材料具有ROS响应性，探索了活性氧响应的纳米粒能否有效用于疫苗递送。此外，针对如何实现高效地疫苗递送问题，利用聚乙烯亚胺(Polyethylenemine，PEI)的疫苗佐剂特性和CD44靶向受体透明质酸(Hyaluronic acid，HA)的纳米运载系统并进行体内外评价，为其更加合理地应用到疫苗领域提供参考。 第一部分：我们设计了3s-PLGA通过过氧草酸酯键连接聚乙二醇，制备了阳离子免疫佐剂PEI修饰的活性氧响应的纳米疫苗。过氧化氢清除实验验证了材料的活性氧响应性，细胞毒实验表明了纳米粒具有良好的细胞相容性，降低了PEI的毒性。共聚焦观察纳米粒吞噬发现，纳米粒可实现溶酶体逃逸，可增强MHCⅠ类途径递送。纳米疫苗刺激小鼠骨髓来源树突状细胞(Bone Marrow-derived Dendritic Cells，BMDC)表面促成熟标记表达高于游离OVA组。纳米粒免疫小鼠后，相比游离OVA刺激淋巴细胞增殖较多，IgG表达增高。研究结果表明活性氧纳米载体系统具有良好的免疫刺激作用，诱导了树突状细胞的成熟，体内T细胞活化以及PEI具有作为免疫佐剂的潜力。 第二部分：我们将通过外表面修饰具有CD44受体靶向的透明质酸过氧化氢敏感性的免疫递送系统。通过体外释放实验观察了其释放行为，体内示踪观察了其在体内的迁移情况，并进行了体内抗体测试和T细胞免疫应答评价。体外纳米粒增强树突状细胞的成熟，体外促进抗原摄取和抗原提呈。体内的免疫实验表明纳米粒有利于促进OVA特异性抗体产生和T细胞反应，同时伴有适度刺激的记忆T细胞的产生。HA修饰的ROS响应性的纳米粒可能是一种有效的抗原传递系统，促进抗原诱导免疫应答。

目录

声明

英文略语表

摘要

第一章前言

1．1活性氧概述

1．2活性氧与致病机制

1．3活性氧响应的纳米载体系统

1．4．1缺血性疾病治疗的应用

1．4．2肿瘤治疗的应用

1．4．3炎症治疗的应用

1．4．4与临床显像的结合

1．5课题的提出

参考文献

第二章阳离子修饰的3s-PLGA-PO-PEG作为疫苗递送载体的应用

2．1前言

2．2实验试剂与仪器

2．2．1实验试剂

2．2．2实验仪器

2．2．3实验动物

2．3实验方法

2．3．2 3s-PLGA-PO-PEG纳米粒的制备及表征

2．3．3 MTT法检测纳米粒的细胞毒性

2．3．4纳米粒的过氧化氢敏感性测试

2．3．5 DC 2．4细胞对抗原的吞噬作用

2．3．6纳米粒促进BMDC成熟的实验

2．3．7纳米粒对树突状细胞交叉呈递及CD8+T细胞激活作用

2．3．8纳米疫苗的体内分布

2．3．9动物免疫反应评价

2．3．10 T细胞增殖反应

2．3．11体内记忆T细胞反应

2．3．12统计学分析

2．4结果与讨论

2．4．1聚合物的表征结果

2．4．2纳米粒子的制备和表征

2．4．3体外的细胞毒性实验结果

2．4．4体外纳米粒对过氧化氢存在的敏感性结果

2．4．5纳米粒增强DC2．4细胞和BMDCs的抗原摄取

2．4．6纳米疫苗诱导DC成熟和抗原的交叉呈递

2．4．7纳米疫苗促进抗原引流到淋巴结

2．4．8纳米疫苗促进抗原特异性抗体的产生，体内T细胞的活化和增殖

2．5小结

参考文献

第三章具有CD44靶向和活性氧响应性的纳米粒抗原传递系统

3．1前言

3．2实验试剂与仪器

3．2．2实验仪器

3．2．3实验动物

3．3实验方法

3．3．1 3s-PLGA-PO-PEG的合成

3．3．2纳米疫苗的制备和表征

3．3．3体外纳米粒清除过氧化氢的能力

3．3．4树突状细胞活性测试

3．3．5细胞摄取和抗原的胞内定位

3．3．6骨髓树突状细胞的刺激和成熟

3．3．7体外抗原的交叉呈递

3．3．8纳米粒的体内迁移实验

3．3．9体内免疫，抗体产生和体外的细胞增殖实验

3．3．10体内T细胞激活

3．3．11数据分析

3．4．1纳米粒的表征

3．4．2体外纳米粒的过氧化氢响应性

3．4．3纳米粒的体外细胞毒牲

3．4．4纳米粒增强抗原摄取，DC成熟和交叉呈递

3．4．5纳米疫苗提高抗原体内迁移

3．4．6纳米疫苗提高体内T细胞激活和抗体产生

3．4．7纳米疫苗增强记忆T细胞在体内的增殖

3．5小结

参考文献

第四章全文总结

文章发表情况

个人简介

致谢