MGUS及多发性骨髓瘤患者中调节性T细胞亚群数量与功能的研究

摘要

多发性骨髓瘤（Multiple myeloma，MM）是一种常见的血液系统恶性肿瘤，多见于老年人，主要临床表现为肾功能不全、溶骨病变、贫血和高钙血症等。几乎所有的MM均是从意义未明的单克隆丙种球蛋白血症（Monoclonal gammopathy of undetermined significance，MGUS）进展而来。目前该病的发病机制尚未明确。肿瘤微环境中的免疫细胞，例如具有独特免疫抑制功能的调节性T细胞(Regulatory T cell，Treg)可能在其中发挥着重要作用。既往文献虽然报道了多发性骨髓瘤患者体内Treg细胞的异常改变，但并未根据功能和表型对Treg细胞亚群进行细化，且大多选取外周血作为研究对象，很难真实反映出肿瘤微环境中Treg细胞的变化。因此本文将对多发性骨髓瘤及MGUS患者外周血及骨髓中Treg细胞亚群及Treg样细胞的数量和功能进行初步研究。 目的： 探究多发性骨髓瘤及MGUS患者的外周血和骨髓中是否存在着Treg细胞亚群以及衰老的Treg样细胞的数量及功能的异常，以及该异常是否随着MGUS向MM进展过程中存在着变化，以期进一步阐明MM发生发展过程中的免疫缺陷机制。 方法： 本研究纳入北京协和医院2017年11月至2018年5月诊治的20例MGUS患者和60例多发性骨髓瘤患者。采用流式细胞术分析患者外周血及骨髓中Treg细胞亚群及衰老的Treg样细胞的比例。同时收集临床资料，分析Treg亚群数量及其变化与患者疾病状态、危险分层和疾病严重度之间的相关性。利用流式分选技术分离出初治多发性骨髓瘤患者骨髓中的Treg细胞亚群及效应T细胞，进行体外共培养。采用CFSE活细胞标记法检测效应T细胞的增殖情况，间接判断Treg细胞亚群的免疫抑制功能。采用ELISA方法检测共培养上清中Treg细胞分泌的抑制性细胞因子IL-10的水平，探究Treg细胞亚群分泌功能的变化。 结果： 1.MM及MGUS患者体内Treg细胞亚群的数量变化 (1)在外周血中，MGUS、初治MM和复发/难治性MM患者的活化Treg(aTreg)细胞占CD4+T细胞比例均较健康人有明显升高(P＜0.01);MGUS和初治MM患者静息Treg(rTreg)细胞比例与健康对照相比无差异(P=0.7167，P=0.0740)，复发/难治性MM患者rTreg比例明显低于对照组(P=0.0108);而MGUS和MM患者外周血无抑制功能Treg(non-Treg)细胞比例与正常人无明显差异(P＞0.05)。 (2)在骨髓中，MGUS、初治MM、复发/难治性MM和治疗平台期患者的aTreg细胞占CD4+T细胞比例均较对照组有明显升高(P＜0.001);MGUS、初治MM和治疗平台期患者的rTreg细胞比例较对照组下降(P=0.0185，P=0.0082)，但复发/难治性MM患者rTreg数量与健康人相比无差异(P=0.0518);MGUS和MM患者的non-Treg细胞比例与正常人无明显差异(P＞0.05)。 2.MM及MGUS患者体内Treg细胞亚群的功能变化 (1)初治MM患者骨髓中aTreg细胞的抑制率明显高于rTreg(P=0.0002);non-Treg细胞的抑制率明显低于rTreg细胞(P＜0.0001);健康对照的aTreg细胞(P=0.2100)、rTreg细胞(P=0.0783)和non-Treg细胞(P=0.0894)的抑制率，与MM患者相比无明显差异。 (2)初治MM患者non-Treg细胞分泌的IL-10水平显著高于aTreg和rTreg;初治MM患者Treg细胞亚群的IL-10分泌水平与健康对照无差异。 3.MM及MGUS患者体内Treg样细胞的比例变化 (1)外周血中，MGUS、初治MM和复发/难治性MM患者外周血中CD4+CD28-FoxP3+Treg样细胞占CD4+T细胞比例较对照组逐渐升高(P＜0.001)。同时，初治MM患者Treg样细胞也较MGUS患者明显升高(P=0.0142)。 (2)骨髓中，MGUS、初治MM、复发/难治性MM和治疗平台期患者CD4+CD28-FoxP3+Treg样细胞占CD4+T细胞比例均较对照组均有不同程度的升高(P＜0.001)。初治MM患者Treg样细胞明显高于MGUS患者(P=0.0027)。 (3)低危(P=0.0016)、低中危(P＜0.001)、中高危组(P＜0.001)MGUS患者骨髓中CD28-Treg样细胞占CD4+T细胞比例较健康对照均有明显升高。 结论： 1.MGUS和MM患者外周血和骨髓中Treg细胞亚群、Treg样细胞存在明显的数量改变，并与疾病状态、治疗反应相关。 2.初治MM患者骨髓中Treg细胞亚群的免疫调节功能较健康人无明显差异：活化Treg细胞可以有效抑制效应T细胞的增殖，静息Treg细胞可部分抑制，而non-Treg细胞虽不能抑制Teff增殖，但可以通过分泌细胞因子发挥免疫调节作用。 3.MGUS患者外周血和骨髓中aTreg细胞和衰老的Treg样细胞比例较正常人明显升高，提示MGUS患者体内已经存在免疫调节功能的异常。

目录

摘要

前言

第一部分Treg细胞亚群在多发性骨髓瘤和MGUS患者中数量的变化

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．结论

第二部分多发性骨髓瘤患者Treg细胞亚群体外培养与抑制功能的研究

1．材料与方诘

2．结果

3．讨论

4．结论

第三部分多发性骨髓瘤及MGUS患者中Treg样细胞的测定

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．结论

参考文献

缩略词表

综述 从意义未明的单克隆丙种球蛋白血症到多发性骨髓瘤：T细胞异常的研究进展

致谢

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