树鼩免疫细胞交叉反应性抗体筛选与表型分析

摘要

目的:树鼩是一种小型哺乳动物，属攀鼩目、树鼩科。树鼩的亲缘关系与灵长类很接近，其实验研究结果易于应用到人类的医学生物学研究当中。科学家们成功地驯化和培育了一定数量的树鼩，并广泛用于疾病模型的建立。同时，还建立了一系列有关树鼩作为实验动物的标准。免疫系统在机体抵抗外界环境中各类微生物、毒素和致癌物质等方面都起着非常重要的作用，免疫应答的监测是动物模型应用中不可缺少的部分。而树鼩免疫系统信息的缺乏，导致我们不能深入地研究疾病的致病机理，以及研究疾病的防治措施。因此，对于树鼩的免疫系统的研究与分析显得尤为重要，本文主要对树鼩免疫细胞表型进行分析和研究。 方法:1.比较四种试剂裂解树鼩外周血红细胞的效果，然后选取可以使细胞成群分布、分界明显，而且红细胞裂解更为完全的裂解液，对其进行优化，包括裂解液与全血的体积比、单次裂解时间、裂解次数和外周血起始体积等。2.基于“针对某一种属抗原的抗体可能存在与其它种属的同类抗原的交叉反应性”，我们从商业化的抗体中进行抗体筛选。通过流式细胞分析进行抗体的交叉反应性分析，找出反应性最强的抗体克隆。3.利用筛选出的具有交叉反应性的抗体对树鼩免疫细胞表型进行分析。通过流式细胞分析的方法，算出各类细胞的百分比。并对不同性别、不同年龄的树鼩进行比较。 结果:1.使用10倍于全血体积的裂解液，进行两次裂解（10min和5min）对体积为300μl的外周血进行裂解，能够得到最好的裂解效果，即裂解后残余的红细胞最少、细胞分群明显和细胞活性较高。2.在试验过的98种抗体中，有74种抗体与树鼩外周血免疫细胞有较好的交叉反应性，有65种抗体与树鼩骨髓免疫细胞有较好的交叉反应性，有62种抗体与树鼩脾脏免疫细胞有较好的交叉反应性。这些免疫细胞表面标记包括:CD3、CD4、CD8、CD19、CD20和CD45等26类，涵盖了淋巴细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞等各类免疫细胞亚型表面标记分子。3.树鼩免疫细胞表型特征初步探索。其中树鼩外周血中CD3+CD4+CD45+细胞在白细胞中的比例为2.15％～8.25％，CD3+CD8+CD45+细胞在白细胞中的比例为5.80％～7.64％，CD19+CD20+CD45+细胞在白细胞中的比例为3.02～9.56％，CD16+CD56+细胞在白细胞中的比例为24.19％～32.72％，CD11b+CD14+细胞在白细胞中的比例为3.48％～15.03％，CD11b+CD13+CD16+CD45+细胞在白细胞中的比例为0.04％～3.33％;树鼩骨髓中CD3+CD4+CD45+细胞在白细胞中的比例为2.17％～6.39％，CD3+CD8+CD45+细胞在白细胞中的比例为1.57％～7.06％，CD19+CD20+CD45+细胞在白细胞中的比例为0.41％4.70％，CD16+CD56+细胞在白细胞中的比例为14.20％～32.00％，CD11b+CD14+细胞在白细胞中的比例为3.46％～8.70％，CD11b+CD13+CD16+CD45+细胞在白细胞中的比例为0.01％～0.86％;树鼩脾脏中CD3+CD4+CD45+细胞在白细胞中的比例为1.37％～2.15％，CD3+CD8+CD45+细胞在白细胞中的比例为5.26％～12.00％，CD19+CD20+CD45+细胞在白细胞中的比例为0.45％～6.65％，CD16+CD56+细胞在白细胞中的比例为13.34％18.74％。 结论:本研究通过筛选和优化能与树鼩抗原发生交叉反应的抗体，并利用这些抗体分析树鼩免疫细胞表型，初步建立树鼩免疫细胞表型的一些数据，为进一步的树鼩细胞表型特性分析和树鼩的各种疾病模型评价提供了坚实的理论基础和必要的研究平台。

目录

摘要

前言

1．树鼩为疾病模型的应用

2．细胞免疫表型分析

3．流式细胞分析术

4．抗体

5．课题研究目的及意义

第一章树鼩外周血红细胞裂解方法的研究

1．2．3实验仪器

1．3实验方法

1．3．1采血方法

1．3．2流式细胞分析评估红细胞裂解的有效性

1．3．3红细胞裂解

1．3．4优化红细胞裂解条件

1．3．5碘化丙啶染色

1．3．6免疫表型染色

1．4实验结果

1．4．3树鼩外周血红细胞裂解条件的优化

1．4．4外周血体积对红细胞裂解的影响

1．4．5应用红细胞裂解优化后的方法进行免疫表型分析

1．5本章小结

第二章树鼩免疫细胞表型抗体的筛选

2．1引言

2．2实验材料

2．2．2实验试剂

2．2．3实验仪器

2．3实验方法

2．3．2树鼩骨髓单细胞悬液样品的制备

2．3．3树鼩脾脏单细胞悬液样品的制备

2．3．4染色

2．3．5交叉反应性抗体的筛选

2．3．6树鼩原代细胞培养刺激实验

2．3．7抗体特异性的检验

2．3．8交叉反应性抗体滴度实验

2．4实验结果

2．4．2树鼩样品中筛选到具有交叉反应性的抗体

2．4．3相同克隆不同公司的抗体间的比较

2．4．4相同公司相同克隆不同染色抗体间的比较

2．4．5同型对照和Fc受体封闭

2．4．6树鼩原代细胞培养

2．4．7磁珠分选

2．4．8免疫荧光和吉母萨染色

2．4．9抗体滴度

2．5本章小结

第三章树鼩外周血、骨髓和脾脏中免疫细胞表型的分析

3．1引言

3．2实验材料

3．2．1实验试剂

3．2．2实验仪器

3．3实验方法

3．3．3树鼩脾脏单细胞悬液样品的制备

3．3．4各类免疫细胞的细胞表面标记

3．3．5染色

3．3．6 FMO对照

3．4实验结果

3．4．1树鼩中外周血中各类免疫细胞百分比

3．4．2树鼩中骨髓中各类免疫细胞百分比

3．4．3树鼩中脾脏中各类免疫细胞百分比

3．5本章小结

第四章分析和讨论

4．1讨论

4．2结论

参考文献

附录

个人简介

致谢

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