Galectin家族成员诱导HIV感染巨噬细胞凋亡的作用机制研究

摘要

目的：艾滋病是一种严重威胁人类健康的疾病，目前通常采用高效抗逆转录病毒疗法治疗，该疗法能够显著改善艾滋病人的生存质量但由于病毒潜伏库的存在无法彻底治愈艾滋病。单核-巨噬细胞是HIV一类重要的潜伏感染靶细胞，如何诱导HIV感染的单核-巨噬细胞凋亡是目前的研究热点之一。因此，本文对Galectin家族成员诱导HIV感染巨噬细胞凋亡的作用机制进行了相关研究。 方法：为了研究Galectin家族成员对HIV感染巨噬细胞凋亡的影响，首先选用不同浓度Galectins诱导单核细胞(THP-1)细胞凋亡，摸索出合适的Galectin浓度，然后用PMA将单核细胞(THP-1)刺激分化成为巨噬细胞(THP-1-M(φ))，再制备HIV-1病毒并用其感染巨噬细胞，最后选用5uM Galectin-2、5uM Galectin-4、7.5uM Galectin-7、3uM Galectin-8、1uM Galectin-9处理单核细胞(THP-1)、巨噬细胞(THP-1-M(φ))和HIV感染的巨噬细胞(HIV-THP-1-M(φ))并检测其凋亡情况。为了研究Galectin家族成员诱导单核细胞(THP-1)凋亡是否和caspase通路相关，首先在用FasL诱导JE6-1细胞凋亡时加入不同浓度Caspase广谱抑制剂(Z-VAD)、Caspase-3抑制剂(Z-DEVD)、Caspase-9抑制剂(Z-LEHD)，摸索出Caspase广谱抑制剂(Z-VAD)、Caspase-3抑制剂(Z-DEVD)、Caspase-9抑制剂(Z-LEHD)的合适使用浓度，然后分别用5uM Galectin-2、5uM Galectin-4、7.5uM Galectin-7、3uM Galectin-8、1uM Galectin-9诱导单核细胞(THP-1)凋亡时加入Caspase广谱抑制剂(Z-VAD)、Caspase-3抑制剂(Z-DEVD)和Caspase-9抑制剂(Z-LEHD)，再检测5uM Galectin-2、5uM Galectin-4、7.5uM Galectin-7、3uM Galectin-8、1uM Galectin-9诱导单核细胞(THP-1)凋亡情况。同时用蛋白质免疫印迹法检测5uM Galectin-2、5uM Galectin-4、7.5uM Galectin-7、3uM Galectin-8、1uM Galectin-9诱导单核细胞(THP-1)凋亡时Caspase-3活化及PARP切割情况。 结果：针对巨噬细胞(THP-1-M(φ))，未添加Galectin家族成员的对照组巨噬细胞(THP-1-Mφ)凋亡率为4.39％±0.74％，5uM Galectin-2、5uM Galectin-4、7.5uM Galectin-7、3uM Galectin-8、1uM Galectin-9分别诱导巨噬细胞(THP-1-M(φ))的凋亡率为4.78％±0.41％、7.21％±1.46％、3.78％±1.03％、5.88％±2.08％、8.10％±4.13％，各Galectin处理组与对照组相比，无统计学差异。针对HIV-1感染的巨噬细胞(HIV-1-THP-1-M(φ))，未添加Galectin家族成员的对照HIV-1感染巨噬细胞(HIV-1-THP-1-M(φ))凋亡率为12.69％±1.16％;5uM Galectin-2、5uM Galectin-4、7.5uM Galectin-7、3uM Galectin-8、1uM Galectin-9诱导HIV-1感染的巨噬细胞(HIV-1-THP-1-M(φ))凋亡率分别为11.69％±0.90％、17.45％±1.30％、32.01％±1.30％、15.77％±1.21％、19.27％±2.13％,Galectin-7处理组与对照组相比，具有统计学差异(p＜0.001)。5uM Galectin-2、5uMGalectin-4、7.5uM Galectin-7、3uM Galectin-8、1uM Galectin-9分别诱导单核细胞(THP-1)凋亡率为19.66％±0.74％、56.31％±10.60％、21.74％±2.39％、31.85％±5.56％、88.75％±4.25％;加入Caspase广谱抑制剂(Z-VAD)后凋亡率分别为7.33％±0.47％、8.41％±0.47％、6.50％±1.90％、17.74％±0.23％、8.34％±0.90％;加入Caspase-3抑制剂(Z-DEVD)后凋亡率分别为9.17％±0.42％、10.37％±0.15％、7.54％±1.65％、20.98％±1.96％、9.03％±0.92％;加入Caspase-9抑制剂(Z-LEHD)后凋亡率分别为25.41％±0.21％、24.28％±3.33％、15.27％±0.89％、25.42％±5.11％、21.58％±4.74％。统计结果表明，5uM Galectin-2、5uM Galectin-4、7.5uM Galectin-7、1uMGalectin-9诱导单核细胞(THP-1)凋亡时，与未添加Caspase抑制剂的对照组相比，加入Caspase广谱抑制剂(Z-VAD)和Caspase-3抑制剂(Z-DEVD)后5uM Galectin-2、1uMGalectin-9诱导单核细胞(THP-1)凋亡率明显降低，结果有显著性差异(P＜0.01)，5uM Galectin-4、7.5uM Galectin-7诱导单核细胞(THP-1)凋亡率明显降低，结果有显著性差异(P＜0.05);5uM Galectin-2诱导单核细胞(THP-1)凋亡时，在加入Caspase-9抑制剂(Z-LEHD)后细胞凋亡率增加，结果有显著性差异(P＜0.05);5uM Galectin-4、7.5uMGalectin-7诱导单核细胞(THP-1)凋亡时，加入Caspase-9抑制剂(Z-LEHD)对细胞凋亡率无明显作用，结果无显著性差异（P＞0.05），luM Galectin-9诱导单核细胞(THP-1)凋亡时，加入Caspase-9抑制剂(Z-LEHD)细胞凋亡率明显降低，结果有显著性差异(P＜0.01）。3uM Galectin-8诱导单核细胞(THP-1)凋亡时，与未添加Caspase抑制剂的对照组相比，加入Caspase广谱抑制剂(Z-VAD)、Caspase-3抑制剂(Z-DEVD)和Caspase-9抑制剂(Z-LEHD)后细胞凋亡率无明显变化，结果无显著性差异（P＞0.05）。同时用蛋白质免疫印迹法检测5uM Galectin-2、5uM Galectin-4、7.5uM Galectin-7、3uM Galectin-8、1uM Galectin-9诱导单核细胞(THP-1)凋亡时Caspase-3活化及PARP切割情况，发现5uM Galectin-2、5uM Galectin-4、7.5uM Galectin-7、1uM Galectin-9诱导单核细胞(THP-1)凋亡时既可以检测到大小为32kD的Caspase-3还可以检测到活化的大小为17kD和12kD的cleaved Caspase-3。同时检测到PARP条带减弱，cleaved PARP条带增强;3uM Galectin-8诱导单核细胞(THP-1)凋亡时，只检测到大小为32kD的Caspase-3，同时检测到PARP和cleaved PARP条带与对照组差异不大。 结论：与未添加Galectin家族成员的HIV-1感染的巨噬细胞相比，7.5uMGalectin-7能够特异性诱导HIV-1感染的巨噬细胞发生大量凋亡。Galectin-2、Galectin-4、Galectin-7、Galectin-9诱导单核细胞(THP-1)凋亡与Caspase通路相关，Galectin-8诱导单核细胞(THP-1)凋亡与Caspase通路不相关。

目录

英文缩写词

摘要

第一部分Galectin家族成员对HIV感染巨噬细胞凋亡的影响

第一节引言

第二节实验材料

第三节实验方法

第四节实验结果

第五节讨论

第二部分Galectin家族成员诱导单核细胞凋亡相关机制研究

第一节引言

第二节实验材料

第三节实验方法

第四节实验结果

第五节讨论

参考文献

文献综述——半乳糖凝集素-3的临床作用

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