诱导HIV感染细胞凋亡的人IgM抗体和用于HIV感染的药物

摘要

一种属于人IgM的单克隆抗体，其特别识别HIV感染细胞，并诱导感染细胞凋亡。使用获得的抗体，提供一种用于HIV感染病人的药物，该药物包括作为有效成分的人IgM抗体，所述抗体可特别与HIV感染细胞反应，诱导感染细胞凋亡，从而破坏细胞等。

说明书

技术领域

本发明涉及人IgM单克隆抗体，所述抗体特别作用于HIV感染细胞，并诱导HIV感染细胞凋亡，本发明还涉及含有此抗体作为有效成分的抗HIV感染的药物。

背景技术

现在已发展出多种制剂，如逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂，用于治疗HIV感染。共同使用三或四种这些制剂进行多药物疗法(所谓高活性抗逆转录疗法(highly active antiretroviral therapy)：HAART)对HIV感染患者有效，使其血HIV浓度大幅下降，CD4淋巴细胞数量上升。但是，HAART无法清除潜伏的感染细胞，治愈HIV感染患者。因此，存在的问题是当药物治疗停止时，HIV在潜伏感染细胞中重生并增殖。

虽然已有报道，间歇性重复中断和恢复HAART有时可有效诱导对HIV的免疫反应，此方法不被认为是可靠的疗法。但是这个结果表明了免疫反应对HIV的重要性。

虽然特别作用于HIV感染细胞的人单克隆抗体已通过基因重组制备，它们是IgG类的抗体。虽然IgG抗体为抑制HIV感染的中和抗体，它不能伤害感染细胞。

由于在人细胞膜上存在种族特异性补体调控膜因子(如DAF，衰变加速因子(decay accelerating factor)；MCP，膜辅助因子蛋白(membrane cofactorprotein)；以及HRF20，20kDa同源限制因子(20kDa homologous restrictionfactor))，它们通过补体反应不能诱导细胞裂解反应，以阻止同源人补体的反应。

另一方面，人血清中与HIV感染细胞反应的IgM抗体被发现可依靠人补体越过补体调控膜因子，使HIV感染细胞产生细胞裂解反应。IgM抗体被发现可对神经节苷脂如GM2和Gg4表现出类似上述的反应，而神经节苷脂的表达为被HIV感染增强(Japanese Patent Application Laid-Open No.9-227409，page 2，paragraph[0009])。

L55被报道为人类抗GM2神经节苷脂IgM单克隆抗体，其中L55由无限增殖的EB病毒转形人B淋巴细胞产生。用人类IgM单克隆抗体处理后的HIV感染细胞被发现通过人补体反应产生裂解。但是，由于L55抗体不是特别作用于HIV感染细胞，它还可作用于非HIV感染细胞的正常细胞。

发明内容

本发明的目的是为HIV感染患者提供药物，所述药物含有作为有效成分的人IgM抗体，所述抗体特别与HIV感染细胞反应，诱导感染细胞凋亡，以导致细胞破坏。

为解决上述问题，本发明的第一个方面是提供一种属于人IgM的抗原(antigen)，它特别地识别HIV感染细胞并诱导细胞凋亡。

本发明的第二个方面是提供用于HIV感染的药物，它含有作为有效成分的人IgM抗体，此抗体特别地识别HIV感染细胞并诱导HIV感染细胞凋亡。

本发明的第三个方面是根据第二个方面提供用于阻止AIDS发病的药物。

本发明的第四个方面是根据第一到第三个方面中的任意一个提供人IgM单克隆抗体，其中作用于HIV感染细胞的人IgM单克隆抗体为2G9抗体，此抗体具有序列号1表示的H链可变区碱基序列。

本发明的第五个方面是根据第一到第四个方面中的任意一个提供人IgM单克隆抗体，其中作用于HIV感染细胞的人IgM单克隆抗体为2G9抗体，此抗体具有序列号2表示的L链可变区碱基序列。

附图说明

图1示出了2G9抗体的特异性。

流式细胞仪(flow cytometory)分析的结果表明HIV感染细胞被2G9抗体染色，而非感染细胞则没有(PBMC：外周血淋巴细胞(peripheral bloodlymphocyte)；IIIB，原代分离(primary isolate)、MN表示HIV名称)。

图2示出2G9抗体也可与HIV潜伏感染细胞反应。

OM10.1细胞为潜伏感染细胞，可与2G9抗体作用，但它们不作为抗HIV膜蛋白抗原与gp120抗体(0.5β)反应。

图3示出了带有HIV2G9抗体的感染细胞的凋亡。

它示出HIV感染的MOLT-4/IIIB细胞在以50μg/ml的浓度加入2G9抗体的培养物中培养2天后，通过TUNEL法，MOLT-4/IIIB细胞被凋亡探测试剂完全染色。无感染的MOLT-4细胞没有受任何影响。

图4示出带有2G9抗体的HIV潜伏感染细胞的凋亡。

它示出2G9抗体以12.5μg/ml的浓度加入到HIV感染的OM10.1细胞中，细胞培养2天，与凋亡探测试剂Annexin V反应的细胞比例与无抗体加入的比例相比，从5.5％增加到21.2％。

图5例示2G9μ链表达质粒的结构。

具体实施方式

虽然关于本发明通过实施例被详细说明，本发明的技术范围不被这些实施例所限制。

为解决以上问题，本发明的发明人用免疫小鼠(TC鼠：转染色体小鼠；Kirin Brewery Co.，Ltd.制备)的HIV感染细胞，该小鼠中被转入含有人免疫球蛋白基因的染色体，获得可产生特别作用于HIV感染细胞的人抗体的小鼠。通过传统的方法，融合免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞株，制备杂交瘤(hybridoma)。从获得的杂交瘤中选出产生作用于HIV感染细胞单克隆抗体的克隆，并且将所选出的杂交瘤命名为2G9细胞株。2G9细胞株产生的2G9单克隆抗体为人IgM单克隆抗体，含有人μ链人κ链。虽然2G9抗体特别作用于HIV感染细胞，它还可与潜伏感染细胞株OM10.1反应。这些细胞通过诱导凋亡而被破坏，本发明已完成确认。产生本发明2G9抗体的2G9细胞株于2003年5月8号被国际先进工业科学协会-国际专利组织保藏处(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology，International Patent Organism Depository)(Chuo-6，Higashi 1-1-1，TsukubaCity，Ibaraki Pref.)保藏，保藏号(accession number)为FERM BP-8378。

与2G9抗体反应的抗原(2G9抗原)用SDS处理被认为会失去对2G9抗体的反应性。

表1表示κ链和μ链可变区中各编码2G9抗体的基因的碱基序列分析结果。恒定区的碱基序列与报道基因的碱基序列大致相同。

表1

μ链可变区碱基序列

TGCCCTGGATTCCAAGGCCTATCCACTTGGTGATCAGCACTGAGCACCGAGG

ATTCACCATGGAACTGGGGCTCCGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAGAA

GGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAG

CCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTA

CTTATAGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGG

TCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATACTACGCAGACTCAGTGAA

GGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAA

ATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAT

CTCCTTATAGCAGTGGCTGGCCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCT

CCTCA

κ链可变区碱基序列

CTCAGTCAGGACACAGCATGGACATGAGGGTCCCTGCTCAGCTCCTGGGACT

CCTGCTGCTCTGGCTCCCAGATACCAGATGTGACATCCAGATGACCCAGTCT

CCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGG

CGAGTCAGGGCATTAGCAATTATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAA

AGTTCCTAAACTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCAATCAGGGGTCCCA

TCTCGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCA

GCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAAAAGTATAACAGTGC

CCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA

第一个方面，诸如2G9抗体的抗体，可诱导包括OM10.1细胞的HIV感染细胞凋亡。换个说法，此抗体为可特别诱导HIV感染细胞凋亡的IgM单克隆抗体。由于此抗体也可诱导HIV潜伏感染细胞如OM10.1细胞凋亡，它可用作清除HIV感染患者体中潜伏的HIV潜伏感染的药物，这些潜伏感染是化学治疗药物不能起作用的。

用于HIV感染患者的本发明的治疗药物可通过将此药物与生理可接受的载体结合获得，它包含人IgM抗体有效成分，通过特异性作用于HIV感染细胞，诱导HIV感染细胞凋亡，导致其破坏。生理可接受的载体为本领域已知的，包括生理盐缓冲溶液或其它具有缓冲行为的水溶液或溶剂，如乙二醇、甘油、油(例如橄榄油)或可注射有机酯。生理可接受的载体可含有稳定IgM抗体或增强其吸收的化合物。生理可接受的化合物的例子包括糖如葡萄糖、蔗糖和葡聚糖；抗氧化剂如抗坏血酸和谷胱甘肽；螫合剂；蛋白质如白蛋白；以及其它稳定剂和赋形剂。还可进一步加入其它生理活性物质，如转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂。可根据给药途径和目标疾病选择生理可接受载体的任何结合。

实施例1.2G9抗体的特异性

抗HIV感染细胞的2G9抗体的反应性用流式细胞仪进行分析。U937细胞、MOLT-4细胞和CEM细胞的培养细胞株用作受试细胞。所用的HIV感染细胞有通过用HIV-1的IIIB株感染U937细胞制备的U937/IIIB，用原代分离单株感染的U937/原代分离，用MN株感染的U937/MIN，以及用IIIB株感染MOLT-4制备的MOLT-4/IIIB。冲洗2G9抗体处理的细胞后，该细胞用荧光色素标记的抗人IgM抗体染色，细胞的荧光强度用流式细胞仪分析。结果表明，HIV感染细胞U937/IIIB、U937/原代分离、U937/MIN和MOLT-4/IIIB被2G9抗体强烈染色，而未感染的MOLT-4细胞和CEM细胞完全没有被染色。对正常成人外周血淋巴细胞和用植物血凝素刺激后培养3天的外周血淋巴细胞制备的活化淋巴细胞的分析结果表明，这些细胞完全不与2G9抗体反应。因此，这表明2G9抗体特别作用于HIV感染细胞，此抗原不与正常细胞反应(图1)。OM10.1细胞被认为是HIV潜伏感染细胞株，常常不表达抗HIV抗体如gp120。但是，由于2G9抗体作用于OM10.1细胞，这表明2G9抗体可作用于潜伏感染期的细胞(图2)。

实施例2.带有2G9抗体的HIV感染细胞的凋亡

被HIV-1感染的MOLT-4/IIIB细胞以5×10⁵细胞/ml的浓度接种于加入20％失活人血清的RPMI1640培养基，加入同等体积100μg/ml的2G9抗体溶液，细胞在含有5％二氧化碳的恒温箱中37℃培养2天。培养后以DNA片断作为凋亡指标，用TUNEL法染色，随后用1％多聚甲醛固定细胞，用流式细胞仪分析。如图3所示，没有用2G9抗体处理的细胞没有被染色，而与2G9抗体共同培养的细胞被完全染色。这个结果表明2G9抗体具有诱导感染细胞凋亡的作用。未感染的MOLT-4细胞中没有观察到这样的损伤作用(图3)。

实施例3.带有2G9抗体的HIV潜伏感染细胞的凋亡

OM10.1细胞作为潜伏感染细胞株，以1×10⁵细胞/ml的浓度接种于含20％失活人血清的细胞培养基(RPMI1640 medium)，并加入同等体积12.5μg/ml的2G9抗体溶液，随后37℃培养2天。培养后的细胞用Annexin V作为凋亡探测试剂染色，细胞用1％多聚甲醛固定，用流式细胞仪分析。结果如图4所示，未用2G9抗体处理时，5.5％的细胞被染色，而与2G9抗体共同培养时，21.2％的细胞被染色。因此可以确认2G9抗体还具有诱导HIV潜伏感染细胞OM10.1细胞凋亡的作用。

实施例4.基因工程重建抗体

基于表1所示2G9抗体可变区碱基序列重建2G9抗体的方法的一个实施如下所述，其中2G9抗体产生细胞株用基因工程方法如鸟枪连接法(shot-gun ligation method)建立(Grundstrom，T.et al.，Nucleic Acid Res.13，3305-3316，1985)。

2G9抗体可变区氨基酸序列通过翻译表中的碱基序列获得。2G9抗体可变区中有许多编码此氨基酸序列的碱基序列，如表2所示，如原始2G9抗体可变区的碱基序列以及通过变换密码于获得的碱基序列。从这些序列中选出具有特定限制性内切酶识别片断的碱基序列，使每段达到能作为寡核苷酸化学合成的长度(表2)。

表2：2G9抗体的氨基酸序列中编码同样氨基酸的cDNA实施例

   1

 M   E   L   G   L   R   W   V   F   L   V   A   I   L   E   G   V   Q   C   E

ATA GAA TTA GGT TTA CGT TGA GTT TTT TTA GTT GCT ATT TTA GAA GGT GTT CAA TGT GAA

ATG GAG TTG GGC TTG CGC TGG GTC TTC TTG GTC GCC ATC TTG GAG GGC GTC CAG TGC GAG

        CTT GGA CTT CGA     GTA     CTT GTA GCA     CTT      GGA GTA

        CTC GGG CTC CGG     GTG     CTC GTG GCG     CTC      GGG GTG

        CTA     CTA                 CTA              CTA

        CTG     CTG                 CTG              CTG

 21

 V   Q   L   V   E   S   G   G   G   L   V   K   P   G   G   S   L   R   L   S

GTT CAA TTA GTT GAA TCT GGT GGT GGT TTA GTT AAA CCT GGT GGT TCT TTA CGT TTA TCT

GTC CAG TTG GTC GAG TCC GGC GGC GGC TTG GTC AAG CCC GGC GGC TCC TTG CGC TTG TCC

GTA     CTT GTA     TCA GGA GGA GGA CTT GTA     CCA GGA GGA TCA CTT CGA CTT TCA

GTG     CTC GTG     TCG GGG GGG GGG CTC GTG     CCG GGG GGG TCG CTC CGG CTC TCG

        CTA         AGT              CTA                     AGT CTA     CTA AGT

        CTG         AGC              CTG                     AGC CTG     CTG AGC

 41

 C   A   A   S   G   F   T   F   S   T   Y   S   M   N   W   V   R   Q   A   P

TGT GCT GCT TCT GGT TTT ACT TTT TCT ACT TAT TCT ATA AAT TGA GTT CGT CAA GCT CCT

TGC GCC GCC TCC GGC TTC ACC TTC TCC ACC TAC TCC ATG AAC TGG GTC CGC CAG GCC CCC

    GCA GCA TCA GGA     ACA     TCA ACA     TCA              GTA CGA     GCA CCA

    GCG GCG TCG GGG     ACG     TCG ACG     TCG              GTG CGG     GCG CCG

            AGT                 AGT         AGT

            AGC                 AGC         AGC

 61

 G   K   G   L   E   W   V   S   S   I   S   S   S   S   S   Y   I   Y   Y   A

GGT AAA GGT TTA GAA TGA GTT TCT TCT ATT TCT TCT TCT TCT TCT TAT ATT TAT TAT GCT

GGC AAG GGC TTG GAG TGG GTC TCC TCC ATC TCC TCC TCC TCC TCC TAC ATC TAC TAC GCC

GGA     GGA CTT         GTA TCA TCA     TCA TCA TCA TCA TCA                  GCA

GGG     GGG CTC         GTG TCG TCG     TCG TCG TCG TCG TCG                  GCG

            CTA             AGT AGT     AGT AGT AGT AGT AGT

            CTG             AGC AGC     AGC AGC AGC AGC AGC

 81

 D   S   V   K   G   R   F   T   I   S   R   D   N   A   K   N   S   L   Y   L

GAT TCT GTT AAA GGT CGT TTT ACT ATT TCT CGT GAT AAT GCT AAA AAT TCT TTA TAT TTA

GAC TCC GTC AAG GGC CGC TTC ACC ATC TCC CGC GAC AAC GCC AAG AAC TCC TTG TAC TTG

    TCA GTA     GGA CGA     ACA     TCA CGA         GCA          TCA CTT     CTT

    TCG GTG     GGG CGG     ACG     TCG CGG         GCG          TCG CTC     CTC

    AGT                             AGT                          AGT CTA     CTA

    AGC                             AGC                          AGC CTG     CTG

101

 Q   M   N   S   L   R   A   E   D   T   A   V   Y   Y   C   A   R   D   L   L

CAA ATA AAT TCT TTA CGT GCT GAA GAT ACT GCT GTT TAT TAT TGT GCT CGT GAT TTA TTA

CAG ATG AAC TCC TTG CGC GCC GAG GAC ACC GCC GTC TAC TAC TGC GCC CGC GAC TTG TTG

            TCA CTT CGA GCA         ACA GCA GTA              GCA CGA     CTT CTT

            TCG CTC CGG GCG         ACG GCG GTG              GCG CGG     CTC CTC

            AGT CTA                                                       CTA CTA

            AGC CTG                                                       CTG CTG

121

 I   A   V   A   G   H   W   G   Q   G   T   L   V   T   V   S   S

ATT GCT GTT GCT GGT CAT TGA GGT CAA GGT ACT TTA GTT ACT GTT TCT TCT

ATC GCC GTC GCC GGC CAC TGG GGC CAG GGC ACC TTG GTC ACC GTC TCC TCC

    GCA GTA GCA GGA         GGA     GGA ACA CTT GTA ACA GTA TCA TCA

    GCG GTG GCG GGG         GGG     GGG ACG CTC GTG ACG GTG TCG TCG

                                             CTA             AGT AGT

                                             CTG             AGC AGC

基于为每个限制性内切酶识别片断分开的碱基序列，化学合成寡核苷酸。在用相应限制性内切酸依次消化合成的寡核苷酸后，将其连接获得编码2G9抗体可变区氨基酸序列的全长碱基序列。通过同样的方法获得2G9抗体H链和L链可变区的cDNA片断，每个片断(分别命名为rVμ2G9和rVκ2H9)整合到含有用同样方法获得的人IgM抗体H链和L链恒定区基因序列(分别为Cμ和Cκ)的载体中，形成嵌合体抗体，获得重组2G9μ链和κ链的表达质粒)分别为rVμ2G9-Cμ和rVκ2G9-Cκ；图5)。

实施例5.重组抗体的表达

使用COS7细胞(ATCC CRL 1651)中的临时表达体系考察抗体的活性，所述抗体使用表达重组2G9抗体基因的质粒获得。采用GIBCO Co.的脂质转染试剂盒，使用两种质粒(rVμ2G9-Cμ和rVκ2G9-Cκ)的混合物以及人IgM抗体J链的表达质粒(Cj)导入基因。继续培养2天，其后采用常规培养条件，取回导入了基因的细胞培养物上清液。使用抗人μ-抗体和抗人κ-抗体，用夹层ELISA法检测系统检测培养物上清液，确认培养物上清液中分泌的重组2G9抗体。使用诸如通过用HIV-1的IIIB株感染U937细胞和MOLT-4细胞制备的U937/IIIB和MOLT-4/HIB细胞，通过FACS分析培养物上清液，抗体被确认具有上述特异性。而且，使荧光标记原始的2G9抗原和培养物上清液同时与U937/IIIB或MOLT-4/IIIB反应，通过此竞争性抑制试验，确认了重组2G9抗体的活性。

随后，表1所列出的2G9抗体μ链和κ链可变区碱基序列被确认为是抗HIV活性的重要区域。

从这些结果还可确认的是编码μ链可变区和κ链可变区碱基序列的基因对于制备重组抗HIV抗体是决定性的基因。

工业应用性

本发明中获得的2G9抗体被确认对潜伏感染的OM10.1细胞有诱导凋亡的行为。2G9抗体还被确认对感染细胞有诱导凋亡的行为。相反，此抗体不损伤未感染的U937和MOLT-4细胞。这些结果表明本发明的2G9抗体可用作药物，清除潜伏在化学疗法无效的感染患者体内的潜伏感染，这是由于抗体可诱导潜伏感染细胞的凋亡。本发明还提供编码μ链可变区和κ链可变区碱基序列的基因，所述区域对于制备重组抗HIV抗体是决定性的。

              序列表

<110>冈田秀亲

     冈田则子

<120>诱导HIV感染细胞凋亡的人IgM抗体和用于HIV感染的药物

<130>T-070102-3

<150>2002-227953

<151>2002-07-01

<160>2

<170>专利版本3.1

<210>1

<211>470

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>人u链的可变区

<220>

<221>V区

<222>(1)..(470)

<223>

<400>1

tgccctggat tccaaggcct atccacttgg tgatcagcac tgagcaccga ggattcacca     60

tggaactggg gctccgctgg gttttccttg ttgctatttt agaaggtgtc cagtgtgagg    120

tgcagctggt ggagtctggg ggaggcctgg tcaagcctgg ggggtccctg agactctcct    180

gtgcagcctc tggattcacc ttcagtactt atagcatgaa ctgggtccgc caggctccag    240

ggaaggggct ggagtgggtc tcatccatta gtagtagtag tagttacata tactacgcag    300

actcagtgaa gggccgattc accatctcca gagacaacgc caagaactca ctgtatctgc    360

aaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ctgtgtatta ctgtgcgaga gatctcctta    420

tagcagtggc tggccactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca               470

<210>2

<211>404

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>人k链的可变区

<220>

<221>V区

<222>(1)..(404)

<223>

<400>2

ctcagtcagg acacagcatg gacatgaggg tccctgctca gctcctggga ctcctgctgc   60

tctggctccc agataccaga tgtgacatcc agatgaccca gtctccatcc tccctgtctg  120

catctgtagg agacagagtc accatcactt gccgggcgag tcagggcatt agcaattatt  180

tagcctggta tcagcagaaa ccagggaaag ttcctaaact cctgatctat gctgcatcca   240

ctttgcaatc aggggtccca tctcggttca gcggcagtgg atctgggaca gatttcactc   300

tCaccatcag cagcctgcag cctgaagatg ttgcaactta ttactgtcaa aagtataaca   360

gtgccccgta cacttttggc caggggacca agctggagat caaa                    404