基孔肯雅病毒nsP1蛋白棕榈酰化的研究

摘要

棕榈酰化是蛋白质翻译后脂类修饰的重要形式，通过调控蛋白质的转运、稳定性和定位来影响蛋白的功能，S棕榈酰化是一种较常见的棕榈酰化形式。基孔肯雅病毒属于披膜病毒科甲病毒属，是一种单股正链RNA病毒。本论文中我们利用蛋白棕榈酰化预测软件对基孔肯雅病毒nsP1的S棕榈酰化位点进行预测，发现其S棕榈酰化位点位于C417-419。我们分别构建了这一区域的单点突变和三点突变的质粒，通过棕榈酰化实验发现这三个位点是nsP1蛋白S棕榈酰化的关键位点。已有研究表明，脂肪酸合成酶抑制剂能抑制基孔肯雅病毒复制，但其机制还不清楚。我们发现脂肪酸合成酶的重要产物——棕榈酸能够拯救脂肪酸合成酶抑制剂对病毒复制的抑制作用，该结果暗示，脂肪酸合成酶抑制剂对病毒的抑制可能是因为nsP1蛋白的S棕榈酰化受到影响。蛋白的S棕榈酰化主要是由具有锌指D-H-H-C结构域的棕榈酰化转移酶（zinc-finger D-H-H-C domain containing-palmitoyltransferase，ZDHHC）所介导的，而基孔肯雅病毒的nsP1是由哪个棕榈酰化转移酶所催化还不清楚。在本研究中，我们试图筛选影响基孔肯雅病毒nsP1蛋白棕榈酰化的棕榈酰基转移酶。将23个ZDHHC与nsP1共转染，同时过表达，通过免疫共沉淀实验发现ZDHHC2和ZDHHC19与nsP1有很强的相互作用，并且当敲降细胞内的ZDHHC2和ZDHHC19后，nsP1蛋白的棕榈酰化水平明显下降，而且病毒复制受到抑制。综上，我们的研究聚焦基孔肯雅病毒nsP1的S棕榈酰化，确定了nsP1蛋白的S棕榈酰化位点，阐明脂肪酸合成酶抑制剂能够削弱nsP1的棕榈酰化，初步探讨了影响nsP1棕榈酰化修饰的棕榈酰化转移酶，揭示了甲病毒属nsP1的S棕榈酰化机制。此外，我们还进行了基孔肯雅病毒与囊泡运输通路关系的研究，初步揭示了COPⅠ组分和COPⅡ组分在基孔肯雅病毒复制中的重要作用。

目录

声明

摘要

一、前言

1．1 基孔肯雅病毒

1．2 非结构蛋白

1．3 脂肪酸合成酶

1．4 脂肪酸合成酶抑制剂

1．5棕榈酰化

1．6 论文研究概述

二、材料与方法

2．1实验材料

2．1．1细胞培养及相关试剂药品

2．1．2抗体

2．1．3病毒

2．1．4抑制剂

2．1．5质粒

2．1．6缓冲液配方

2．1．7试剂盒

2．1．8 生化试剂

2．1．9实验仪器

2．2．1细胞培养

2．2．2基孔肯雅病毒疫苗株制备

2．2．3构建质粒

2．2．4 免疫共沉淀

2．2．5免疫印迹

2．2．6免疫荧光

2．2．7 qPCR

2．2．8 RNA干扰

2．2．9 ABE实验

2．2．10空斑计数实验(Plaque assay)

三、实验结果

3．1基孔肯雅病毒的制备

3．2 nsP1棕榈酰化的关键位点是417-419位的半胱氨酸

3．3 nsP1 417-419位半胱氨酸的缺失抑制病毒复制

3．4 脂肪酸合成酶抑制剂降低nsP1的棕榈酰化水平和细胞表面定位

3．5 病毒侵染会改变脂肪酸合成酶在细胞内的量

3．6 脂肪酸合成酶抑制剂抑制病毒复制

3．7棕榈酸能拯救脂肪酸合成酶抑制剂以及2-BP对病毒的抑制作用

3．8 ZDHHC2和ZDHHC19是催化nsP1蛋白棕榈酰化的主要酶

3．9模式图

3．10其他工作

四、讨论

参考文献

附录

致谢

个人简历