小檗碱改善动脉粥样硬化小鼠的血管炎性反应和钙化

摘要

背景与目的： 动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是冠心病、脑梗死、外周血管病的主要原因。随着生活水平的提高,动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)性疾病已跃居于人口死亡的主要原因之列。动脉粥样硬化的发病机制很复杂,目前关于动脉粥样硬化的病因较为一致的看法是因脂质代谢紊乱、炎性细胞浸润、氧化应激、血管内皮细胞损伤和平滑肌细胞激活等,这些机制并非独立发挥作用,而是相互渗透,因果循环,最终导致斑块的破裂,血栓形成,造成严重心脑血管疾病。临床上最常用的治疗动脉粥样硬化的药物为他汀类降脂药,但长期使用他汀类药物可能造成肝损伤,所以开发新型治疗药物也是目前的研究热点。 小檗碱(berberine,BBR)是一种从黄连和黄柏中提取出来的中药成分,一直以来广泛用于胃肠炎和细菌性痢疾,近年来发现它是一种新型的降低胆固醇的药物,其作用机制目前尚未完全阐明,但是与常用的治疗动脉粥样硬化的他汀类药物不同。近年来对于小檗碱的降脂机制,讨论最多的观点是小檗碱可以上调LDL受体的表达。对于它改善动脉粥样硬化的其他作用机制,目前证据有限。本文将从调节血管内皮炎性反应和影响血管钙化的角度对BBR的作用机制进行探讨。 由于动脉粥样硬化伴随着严重的内皮损伤和炎性反应,因此本课题以Apo-/-E小鼠和人脐静脉内皮细胞HUVEC为研究对象建立了动脉粥样硬化和血管内皮炎症模型,来探讨BBR是否通过调节血管内皮炎性反应来抑制动脉粥样硬化的发生发展。血管钙化是临床上动脉粥样硬化检查的重要指标之一,因此本课题以Apo-/-E小鼠和人主动脉平滑肌细胞HASMC细胞为研究对象建立了动脉粥样硬化和钙化模型,来探讨BBR是否通过调节血管钙化来发挥缓解动脉粥样硬化的作用。 方法： 6～8周龄的雄性Apo-/-E小鼠随机分为对照组(Control)、模型组(Model)(给予高脂饲料喂养4周)、小檗碱组(BBR)[灌胃给予,100mg/(kg·d)]和阿托伐他汀组(Atorvastatin)[灌胃给予,5mg/(kg·d)],给药4周,每组12只。生化分析仪检测小鼠血清中血脂4项总胆固醇(Total Cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(Low Density Lipo Protein Cholesterol,LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(High Density Lipo Protein Cholesterol,HDL-C)含量;酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清和主动脉血管组织中白细胞介素6(Interleukin6,IL-6)、肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)和骨成型蛋白2(Bone Morphogenetic Protein2,BMP-2)的表达;化学发光法检测碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)和钙含量;分离主动脉并进行HE染色和Von Kossa染色,观察血管组织中炎性浸润情况和钙沉积情况;免疫组化检测主动脉血管组织中钙化相关蛋白BMP-2、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)、骨钙蛋白(Osteocalcin,OCN)和转录因子(Runt-related transcription factor2,RUNX2)的表达量;化学发光法检测主动脉组织匀浆中ALP的表达和钙含量。将HUVEC细胞分为CONTROL组、DMSO组(TNF-α刺激24h)和BBR组(浓度分别为7.5,10,15,20mg/L),酶联免疫吸附法(ELISA)检测ICAM、VCAM和MMP-9表达量。将HASMC细胞分为CONTROL组、DMSO组(β-GP诱导钙化)和BBR组(浓度分别为10,15,20mg/L),分别用茜素红染色和钙测试盒检测BBR对胞内钙含量的影响。将HASMC细胞分为CONTROL组、DMSO组(TNF-α诱导建立慢性炎症模型)和BBR组(浓度分别为10,15,20mg/L),用免疫荧光染色检测钙化相关蛋白BMP-2和RUNX2的表达量。 结果： 1.高脂喂养4周可以成功建立Apo-/-E小鼠的动脉粥样硬化模型。与Control组相比,Model组动物血清中血脂4项(TC、TG、LDL-C和HDL-C)水平明显上升(P＜0.05),主动脉血管壁增厚,血管内斑块明显,甚至出现斑块破裂及脱落。 2.血清生化指标检测显示,与Model组相比,灌胃给予BBR l00mg/(kg·d)治疗后可明显降低血清中LDL-C和TC水平(P＜0.05),与阳性药阿托伐他汀的治疗效果相似。病理切片中可见,BBR治疗组小鼠的血管内没有斑块形成,血管壁平滑无增厚,无明显炎性浸润。 3.ELISA结果显示,与对照组相比,Model组动物血清和主动脉组织中炎性因子表达量明显上升。主动脉组织病理切片中显示,Model组动物血管内炎性浸润明显,尤其聚集在斑块处。而BBR可以抑制血清和主动脉组织中炎性因子IL-6和TNF-α的分泌。 4.ELISA结果显示,与Control相比,Model组HUVEC细胞ICAM、VCAM和MMP-9表达上调,BBR可以抑制ICAM、VCAM和MMP-9表达。 5.主动脉切片Von Kossa染色情况显示,与Control相比,Model组血管内钙沉积明显,尤其在斑块处。免疫组化显示血管组织中钙化相关蛋白ALP、BMP-2、OPG、OCN和RUNX2表达量升高(P＜0.05)。BBR治疗后可明显降低血清和组织中的ALP、BMP-2、OPG、OCN、RUNX2和钙含量(P＜0.05)。 6.茜素红染色和钙检测结果显示,β-甘油磷酸钠诱导的Model组HASMC中钙含量明显增加(P＜0.05),BBR可抑制钙含量的增加(P＜0.05)。 7.免疫荧光染色结果显示,TNF-α诱导的慢性炎症模型中,HASMC有明显钙化倾向,钙化相关蛋白BMP-2和RUNX2明显升高,BBR可以显著抑制这种钙化倾向。 结论： 小檗碱对高脂喂养建立的Apo-/-E小鼠动脉粥样硬化模型有较好的治疗效果。小檗碱可以通过降低TC和LDL-C有效调节高脂饮食动物的血清脂质水平,可以减少IL-6和TNF-α等炎性介质的分泌、抑制ICAM、VCAM的释放,从而减轻血管内皮的损伤,提高斑块稳定性;小檗碱可以通过降低血管平滑肌细胞内的钙盐沉积抑制钙化,还可以通过下调ALP、BMP-2、OPG、OCN和RUNX2等钙化相关蛋白的作用来抑制血管钙化,并通过抑制TNF-α的分泌来间接抑制炎性因子对钙化相关蛋白的激活作用,从而间接发挥抑制血管钙化的作用。综上所述,提示小檗碱可能通过调节血管内皮炎性反应和影响血管钙化来改善动脉粥样硬化,发挥心血管保护作用。

目录

摘要

缩略术语表

前言

1．实验动物与细胞系

2．药品与试剂

3．主要仪器

1．常用溶液配制

2．动物模型的建立

3．动物实验样本采集和处理

4． 主动脉标本的HE染色、Von Kossa染色与免疫组化染色

5．血清及主动脉组织中碱性磷酸酶(ALP)的测定

6．血清及主动脉组织中钙含量的测定

7．血清中血脂四项含量的测定

8．ELISA测定

9．细胞模型的建立和取样

10．细胞内蛋白的提取

11．蛋白浓度的测定(BCA法)

12．Caspase 3活性的测定

13．细胞爬片的制作和固定

14．统计学方法

实验结果

1．BBR对高脂饮食小鼠的血脂调节作用

2．BBR对小鼠主动脉形态变化和炎性浸润的影响

3．BBR对主动脉组织中钙盐沉积的影响

4．BBR对主动脉组织中钙化相关蛋白表达量的影响

5．BBR对小鼠血清及血管组织中炎症因子含量的影响

6．BBR对小鼠血清及血管组织中ALP、BMP-2和钙含量的影响

7．BBR对HUVEC细胞ICAM、VCAM和MMP-9分泌的影响

8．BBR对HASMC钙化的影响

9．BBR对慢性炎症模型中HASMC钙化相关蛋白的影响

讨论

1．BBR对小鼠血清脂质水平的影响

2．BBR对小鼠主动脉血管形态的影响

3．BBR对小鼠体内炎性反应的影响

4．BBR对小鼠血管内皮损伤的影响

5．BBR对小鼠血管组织和HASMC钙沉积的影响

6．BBR对小鼠血管组织中钙化相关蛋白的影响

7．BBR抗炎和调节钙化之间的关系

结论

参考文献

文献综述

致谢

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