磷酸类抗原刺激健康人与结核病人外周血γδT细胞中产生IFN-γ和TNF-α细胞数量的比较

摘要

研究背景：结核分枝杆菌（ mycobacterium tuberculosis, Mtb）引起的结核病（tuberculosis, TB）仍是是目前严重危害人类健康的三大感染性疾病之一。如何快速、准确的诊断结核病，是结核病防治的关键。然而，目前对结核病诊断的免疫学指标尚缺乏满意的方法。临床诊断结核病的传统方法如结核菌素皮肤试验、痰抗酸杆菌涂片、痰结核杆菌培养等均存在缺点。近年来，利用酶联斑点免疫试验(enzyme linked immunospot，ELISPOT)检测结核菌特异抗原T淋巴细胞的方法，为结核病快速诊断开辟了一条新的思路。目前临床中使用的检测结核杆菌感染试剂盒(T-SPOT-TB)，通过ELISPOT技术，选用结核杆菌特异性抗原ESAT6和CFP10刺激外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)，检测其中能与抗原发生特异性免疫反应并分泌IFN-γ的T淋巴细胞，以此判断是否感染Mtb。但这种试剂盒不能区分隐匿性Mtb感染者（以下简称隐感者）与TB患者。目前缺乏鉴别MTB隐感者和活动性TB免疫状态的方法。国内外研究证实唑来磷酸（zoledronate，ZOL）、帕米膦酸（pamidronate，PAM）、异戊烯焦磷酸盐（isopentenyl pyrophosphate，IPP）等磷酸类抗原可体外优势扩增γδT细胞。本实验室前期研究初步表明结核病患者γδT细胞受磷酸类抗原一羟基二甲基二烯基四双磷酸铵盐［( E)1-Hydroxy-2-Methyl-but-2-enyl4-Diphosphate ammonium salt，HDMAPP］刺激后产生IFN-γ的比例显著低于健康者及隐感者。
　　目的：用磷酸类抗原刺激健康人、隐感者和TB患者的外周血单个核细胞，比较γδT细胞产生IFN-γ和TNF-α的差异。以阐明健康人、隐感者和TB患者之间γδT细胞免疫功能的差异，为进一步开发新的临床结核病检测试剂盒奠定基础。
　　方法：1.流式细胞术检测磷酸类抗原刺激γδT细胞产生IFN-γ和TNF-α
　　1.1采集3例健康人外周血，分离PBMC后，分别加入不同浓度的IPP、二甲基丙烯焦磷酸盐（Dimethylallyl pyrophosphate，DMPP）、HDMAPP、ZOL，刺激培养14小时，再加莫能霉素（Monensin）继续培养6小时后收集细胞。加荧光标记抗体进行表面分子和胞内染色，在流式细胞仪上检测γδT细胞中表达IFN-γ和TNF-α的比例。
　　1.2采集健康人、隐感者和TB患者的外周血，分离PBMC，用磷酸类抗原刺激培养14小时，再加莫能霉素（Monensin）继续培养6小时后收集细胞。加荧光标记抗体进行表面分子和胞内染色，在流式细胞仪上检测各T细胞亚群产生IFN-γ和TNF-α的比例。
　　2. ELISPOT检测健康人、隐感者和TB患者的外周血PBMC中产生IFN-γ的细胞数
　　运用结核分支杆菌抗原特异性T细胞ELISPOT诊断试剂盒，从健康人人群中筛选出隐感者。采集健康人、隐感者和TB患者的外周血，分离出PBMC并调整细胞浓度（细胞浓度250万/ml），按试剂盒设计每孔加入100μl细胞悬液，再加入磷酸类抗原（IPP、ZOL）刺激，将EISPOT培养板放置在37℃培养箱内培养20小时，进行显色，最后用ELISPOT计数仪进行斑点计数，计算每25万个细胞中产生IFN-γ的细胞数量。
　　3.流式细胞术检测ZOL诱导健康人和结核患者的γδT细胞扩增情况
　　采集健康人和结核患者的外周血，分离PBMC，调整细胞浓度（100-150万细胞/ml），加入ZOL刺激，用含10％血清的RPMI-1640培养液进行培养。培养12天后，收集培养的细胞，用流式细胞仪检测γδT细胞占细胞的比例。比较健康人和结核患者在ZOL诱导前后γδT细胞占细胞的比例的变化。
　　结果:1、不同浓度磷酸类抗原刺激健康人PBMC，用流式细胞术检测γδT细胞产生IFN-γ和TNF-α的百分比。
　　1.1不同浓度ZOL（终浓度：10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L）刺激健康人的PBMC，γδT细胞产生IFN-γ的百分比分别是6.88±0.37、7.38±0.17、10.59±0.36、9.66±1.04，产生TNF-α的百分比分别是12.18±1.02、13.81±0.002、17.69±0.39、16.48±0.58。
　　1.2不同浓度HDMAPP（终浓度：10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L）刺激刺激健康人的PBMC，γδT细胞产生IFN-γ的百分比分别是7.21±0.74、9.65±0.01、15.18±0.42、14.58±0.63，产生TNF-α百分比分别是15.36±2.88、18.35±1.30、26.46±2.64、24.08±0.08。
　　1.3不同浓度IPP（终浓度：5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L）刺激健康人的PBMC，γδT细胞产生IFN-γ的百分比分别是1.48±1.90、1.75±1.15、3.62±0.29、2.20±1.03，产生TNF-α的百分比分别是2.91±2.18、3.83±2.95、7.95±0.32、4.80±1.48。
　　1.4不同浓度DMPP（终浓度：2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L）刺激刺激健康人的PBMC，γδT细胞产生IFN-γ的百分比分别是0.45±0.06、0.62±0.16,、0.86±0.03、1.23±0.26，产生TNF-α的百分比分别是0.80±0.02、1.08±0.21、2.27±0.10、3.15±0.53。
　　2、用结核杆菌ELISOPT检测试剂盒从健康人中筛选出6例隐感者。
　　3、用磷酸类抗原（ZOL、HDMAPP、IPP、DMPP）刺激健康人的PBMC20小时后，用流式细胞术检测，γδT细胞、αβT细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞中产生IFN-γ和TNF-α的百分比。各组中γδT细胞产生IFN-γ和TNF-α的百分比，要明显高于αβT细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞中产生IFN-γ和TNF-α的百分比（p＜0.01）。而各组中αβT细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞中产生IFN-γ和TNF-α的百分比进行比较，无明显差异（P＞0.05）。
　　3.1 ZOL组中γδT细胞、αβT细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞中产生IFN-γ的百分比分别是8.83±2.51、0.02±0.03、0.01±0.03、0.02±0.03，产生TNF-α的百分比分别是17.73±2.79、0.02±0.03、0.03±0.04、0.04±0.03。（p＜0.01）。
　　3.2 HDMAPP组中γδT细胞、αβT细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞中产生IFN-γ的百分比分别是13.46±4.84、0.004±0.009、0.005±0.012、0.03±0.04，产生TNF-α的百分比分别是23.95±5.17、0.01±0.02、0.01±0.03、0.07±0.05。（p＜0.01）。
　　3.3 IPP组中γδT细胞、αβT细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞中产生IFN-γ的百分比分别是6.55±2.75、0.01±0.02、0.01±0.03、0.01±0.03，产生TNF-α的百分比分别是12.06±3.40、0.03±0.03、0.02±0.03、0.03±0.04。（p＜0.01）。
　　3.4 DMPP组中γδT细胞、αβT细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞中产生IFN-γ的百分比分别是，产生IFN-γ的百分比分别是2.20±1.44、0.01±0.01、0.02±0.02、0.001±0.002，产生TNF-α的百分比分别是5.62±2.89、0.03±0.02、0.05±0.04、0.03±0.02。（p＜0.01）。
　　4、用磷酸类抗原（ZOL、IPP）刺激健康人、隐感者和TB患者PBMC后，用流式细胞术检测γδT细胞中产生IFN-γ和TNF-α的比例。TB患者的γδT细胞经ZOL、IPP刺激后产生IFN-γ和TNF-α的细胞比例要明显少于健康人和隐感者，差异有统计学意义（p＜0.01）。
　　4.1 ZOL组中健康人、隐感者和TB患者PBMC中γδT细胞中产生IFN-γ的百分比分别是8.83±2.51、9.70±1.94、2.71±1.51，产生 TNF-α的百分比分别是17.73±2.79、18.86±1.77、6.09±3.32。（p＜0.01）。
　　4.2 IPP组中健康人、隐感者和TB患者PBMC中γδT细胞中产生IFN-γ的百分比分别是6.55±2.75、5.54±3.46、2.32±1.03，产生 TNF-α的百分比分别是12.06±3.40、9.60±3.02、4.54±1.70。（p＜0.01）。
　　5、用EISPOT检测健康人、隐感者和TB患者PBMC经磷酸类抗原（ZOL、IPP）刺激后产生IFN-γ的细胞数量，其中ZOL组分别是707±253、663±193、139±69， IPP组分别是400±203、391±138、75±46。TB患者的PBMC经磷酸类抗原刺激后产生IFN-γ的细胞数量要明显少于健康人和隐感者，差异有统计学意义（p＜0.01）。
　　6、健康人和结核患者的PBMC用ZOL刺激后，培养增殖12天后，γδT细胞占细胞的百分比分别是90.50±2.72、14.30±8.52。差异有统计学意义（p＜0.01）。
　　结论：
　　1.用磷酸类抗原刺激健康人的PBMC后，主要是γδT细胞产生IFN-γ和TNF-α，而αβT细胞几乎不产生IFN-γ和TNF-α。
　　2.用磷酸类抗原刺激后，健康人和隐感者的γδT细胞中产生IFN-γ和TNF-α的细胞比例要明显高于TB患者，健康人和隐感者的PBMC中产生IFN-γ的细胞数量要明显高于TB患者。
　　3.用磷酸类抗原（ZOL）刺激人PBMC，可优势扩增γδT细胞。且健康人γδT细胞扩增的能力要明显强于TB患者。