川芎嗪对人脐静脉内皮细胞脂多糖诱导性损伤及miRNA155、miRNA193b表达的影响

摘要

第一部分川芎嗪对脂多糖诱导的血管通透性增加的保护作用
　　目的：
　　探讨豚鼠体内预处理川芎嗪对脂多糖（LPS）诱导的血管通透性增加有无保护作用及可能机制。
　　方法：
　　白色健康雄性豚鼠18只，按照随机区组设计将体重相近的3只豚鼠配成一个区组，在脂多糖注射前30min分别给予川芎嗪（3或6mg/kg）及生理盐水（NS）静脉给药预处理，后在豚鼠背部皮肤上分别给予脂多糖（100、300、和1000ug/0.1ml/部位）和NS（0.1ml/部位）皮内给药。通过测量皮内注射LPS（100~1000ug/部位）后豚鼠背部皮肤上伊万斯蓝（EB）染料渗出面积及其在610nm处的吸光度（OD610）来评估血管通透性的大小。
　　结果：
　　LPS皮内注射5min内EB染料开始渗出，2h后豚鼠皮肤上的EB染料渗出显著增加。较NS组比较，川芎嗪（3和6mg/kg）预处理后可以显著抑制LPS诱导的染料渗出面积（F=5.77，P<0.05）及渗出染料的OD610（F=7.736，P<0.05）。
　　结论：
　　川芎嗪对脂多糖诱导的内皮细胞通透性增加有保护作用，结合前期实验推测其可能机制为抑制Rho/ROCK信号通路。
　　第二部分川芎嗪对脂多糖诱导的人静脉内皮细胞损伤的影响
　　目的：
　　观察川芎嗪对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的 LIM激酶1（LIMK1）、丝切蛋白（cofilin）表达的影响以及肌动蛋白（F-actin）细胞骨架形态和分布的变化，探讨其可能的作用机制。
　　方法：
　　1.用I型胶原酶灌注消化法分离出单体人脐静脉内皮细胞，在ECM完全培养基中培养，胰酶消化传代，倒置显微镜观察细胞的形态，并予VIII因子相关抗原免疫细胞化学染色鉴定内皮细胞。
　　2.体外培养的人脐静脉内皮细胞随机分成7组，分别为：对照组（加入4ml培养基）、LPS组（ LPS0.1ug/ml）、法舒地尔阳性对照组（法舒地尔3.275ug/ml+LPS0.1ug/ml）、川芎嗪（TMP）组（川芎嗪1500ug/ml）、TMP I组（川芎嗪500ug/ml+LPS0.1ug/ml）、TMPII组（川芎嗪1000ug/ml+LPS0.1ug/ml）、TMPIII组（川芎嗪1500ug/ml+LPS0.1ug/ml）。
　　3.采用激光共聚焦荧光显微镜观察各组细胞的细胞骨架蛋白形态及分布的变化。
　　4.用荧光定量PCR方法检测内皮细胞LIMK1和cofilin mRNA表达。
　　结果：
　　1.人脐静脉内皮细胞原代培养后开始贴壁和完全贴壁时间分别为4~6h和24h，融合成片需3~5d，呈鹅卵石状镶嵌排列，VIII因子相关抗原荧光染色阳性，证实为内皮细胞。
　　2.与对照组相比，LPS组F-actin形态发生明显改变，胞浆F-actin纤维丝增多、增粗，出现密集的束状应力纤维，外周致密带断裂，细胞间隙增大，而川芎嗪处理组细胞的细胞骨架改变可被不同程度地抑制。
　　3.与对照组相比，各实验组LIMK1（F=1.095，P=0.412）、cofilin mRNA（F=0.729， P=0.634）相对表达量无明显差异（P>0.05）。
　　结论：
　　1.酶灌注消化法成功分离和培养了原代人脐静脉内皮细胞。
　　2.川芎嗪对脂多糖诱导的HUVECs细胞骨架改变有一定的保护作用。
　　3. LPS刺激HUVECs后，LIMK1、cofilin基因水平无明显变化。
　　第三部分 miRNA155、miRNA193b在LPS诱导的HUVECs损伤中的作用
　　目的：
　　检测miRNA155、miRNA193b在LPS诱导的HUVECs损伤中的表达水平变化，并观察川芎嗪对这一变化的影响，探讨其可能作用机制。
　　方法：
　　1.体外培养的人脐静脉内皮细胞随机分成4组，分别为：①control组：ECM完全培养基培养4ml，不加特殊处理因素。②TMP组：加入ECM培养基3.7ml和川芎嗪300ul（1500ug/ml）。③LPS组：加入ECM培养基4ml和LPS2ul（0.1ug/ml）。④TMP+LPS组：加入ECM培养基3.7ml+川芎嗪300ul（1500ug/ml）+LPS2ul（0.1ug/ml）。
　　2.利用荧光定量PCR方法检测内皮细胞miRNA155、miRNA193b基因相对表达量。
　　结果：
　　与control组比较，LPS组miRNA155（P=0.004）和miRNA193b（P=0.007）基因相对表达量均明显增高（P值均<0.01），TMP组两种基因表达无明显差异（P>0.05）；TMP+LPS组与LPS组相比，miRNA155的表达量下降，差异有统计学意义（P=0.011），miRNA193-b的表达量无显著下降（P=0.232）。
　　结论：
　　1. LPS作用后，HUVECs内miRNA155、miRNA193b基因相对表达量明显增高。
　　2.川芎嗪对LPS诱导的内皮细胞损伤的保护作用可能通过下调miRNA155的表达，未发现与miRNA193b有关。

目录

封面

声明

目录

第一部分 川芎嗪对脂多糖诱导的血管通透性增加的保护作用

中文摘要

英文摘要

引言

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

结论

参考文献

第二部分 川芎嗪对脂多糖诱导的人静脉内皮细胞损伤的影响

中文摘要

英文摘要

前言

1材料与方法

2 结果

3 讨论

结论

参考文献

第三部分 miRNA155、miRNA193b在LPS诱导的HUVECs损伤中的作用

中文摘要

英文摘要

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

结论

参考文献

全文小结

致谢

附录A英汉缩略词对照表

附录B主要试剂配置方法

附录C个人简历及论文发表情况

附录D综述:Rho/ROCK信号转导通路与呼吸系统疾病