小果油茶种内类型划分、评价及亲缘关系研究

摘要

小果油茶（Camellia meiocarpa Hu.）是我国栽培面积和年产量仅次于普通油茶的油料树种，但对其遗传改良研究仍处于初级阶段。小果油茶为异花授粉植物，种内变异类型极为丰富。为充分挖掘和利用现有的遗传变异，本文在前期充分调查的基础上，对小果油茶种内自然变异类型进行了划分，同时针对小果油茶分类地位仍存在异议的问题，从孢粉学、表型、基因组DNA和基因转录水平上对典型小果油茶类型的亲缘关系进行了研究。主要结论如下:
　　 1.根据小果油茶生物学特性及种群遗传特点，结合前期的调查资料，初步对小果油茶种内变异类型进行了划分。结果表明:小果油茶树体、果实、叶片、花等表型性状变异十分丰富，其中树体性状的变异系数最大（平均CV=43.79％），其次是果实性状（平均CV为26.09％），叶和花性状的变异系数相对较小，平均为16.84％和16.53％。综合R型聚类和主成分分析结果及成熟期等生态表现，提出以果实横径、果皮厚度和成熟期作为类型划分的指标，将小果油茶初步划分为10个类型。
　　 2.比较了部分典型小果油茶类型和普通油茶的花粉形态，并分析其与山茶属物种间的亲缘关系，结果表明:不同类型小果油茶的花粉均具有山茶属植物花粉的种属特征，即:花粉粒为长形球、近球形，赤道面观长椭圆形，极面观三裂圆形，具三孔沟，但花粉粒的外观表面纹饰特征因不同类型而异。相关分析表明，不同小果油茶类型的单果质量、鲜出籽率与花粉粒极轴长（P值）呈显著负相关，与沟间距离呈显著正相关，因此可以通过花粉形态特征来鉴别小果油茶类型。通过比较小果油茶和36个山茶物种间的花粉形态特征，发现小果油茶花粉大小与油茶组、红山茶组的大部分种相似，而与连蕊茶组、短柱茶组、糙果茶组等大部分种相差甚远，初步说明，小果油茶与油茶组和红山茶组的大部分种有较近的亲缘关系。
　　 3.对部分典型小果油茶类型和42个山茶属油用类物种间的亲缘关系进行分析。结果表明:46个物种（类型）的表型性状变异极为丰富，叶片、花、果实及其经济性状等39个性状的变异系数达4.95％～159.41％，尤其是单果质量和单果籽质量的变异系数更是高达159.41％和134.72％;通过聚类分析将46个物种（类型）分为2大类群，其中小果油茶大果薄皮立冬籽（龙眼茶）、中果薄皮霜降籽（羊屎茶）、小果薄皮寒露籽（珍珠茶）和中果薄皮寒露籽（宜春白皮中籽）先与钝叶短柱茶聚在一起，再与短柱茶、粉红短柱茶、小果短柱茶、普通油茶等12个物种聚为一个亚类，说明小果油茶的表型性状和这些物种的表型性状相似性较高。
　　 4、采用AFLP标记对部分典型小果油茶类型和42个山茶属油用类物种间的亲缘关系进行了分析。结果表明:18对AFLP引物组合共检测到642条多态性条带，多态性条带占95.69％;小果油茶羊屎茶与珍珠茶遗传相似系数最大，为0.9539，越南油茶与滇北红山茶遗传相似系数最小(0.5272)。通过聚类分析将46个物种（类型）划分为5个类群:越南油茶和小果短柱茶分别单独为一类;糙果茶组聚为一类;14个红山茶属物种和短柱茶组中果实性状较为类似的陕西短柱茶、攸县油茶和闽鄂山茶聚为一大类;小果油茶与除小果短柱茶外的油茶组、短柱茶组部分种聚为一类。与形态学标记相比较，发现两种标记的聚类结果并不完全一致，但在一定程度上可以互补。
　　 5.以小果油茶和普通油茶的嫩叶及种仁为材料，建立了适合油茶的cDNA-AFLP反应体系。结果表明:总RNA中分离的mRNA经合成双链cDNA后，用限制性内切酶EcoRⅠ和MseⅠ在37℃下5h内完全酶切，经5U T4连接酶16℃连接的产物稀释10倍后直接用于预扩增;在20μL选择性扩增体系中，以预扩增产物稀释30倍为模版、dNTP(10mM)1.5μL、引物(10μM)1.0μL、Taq酶用量1.25U时的扩增效果较好。利用优化体系成功筛选出61对可以获得带型丰富且重复性好的引物组合。
　　 6.为进一步分析典型小果油茶类型间差异的遗传学基础，本文尝试用cDNA-AFLP技术对小果油茶基因表达差异进行分析。138对引物组合共扩增出3649条转录衍生片段(TDFs)，其中差异显示的TDFs有3557个，多态率高达97.48％。研究发现在大果薄皮立冬籽龙眼茶和普通油茶中特异表达的TDFs占总差异带的4.27％，在龙眼茶和宜春白皮中籽中特异表达的TDFs占4.53％，在龙眼茶和羊屎茶中特异表达的TDFs有1.57％，在龙眼茶、羊屎茶和宜春白皮中籽中均特异表达的TDFs占1.88％，而在龙眼茶、宜春白皮中籽和普通油茶中均特异表达的TDFs占3.54％，说明龙眼茶与普通油茶和宜春白皮中籽的亲缘关系可能较近，而与羊屎茶的亲缘关系可能相对较远。基于TDFs表达模式差异的多态性将5个参试材料分为3类，其中龙眼茶和宜春白皮中籽聚为一类，羊屎茶和珍珠茶归为一类，普通油茶独立为一类，这与基因组DNA的AFLP分析结果一致。差异TDFs经回收及测序，获得了789个差异基因片段。经BlastX/N同源性比对，有716个在GeneBank中找到了同源序列，其功能主要涉及信号转导、转录因子、蛋白质合成、代谢、运输、细胞防御等方面。
　　 以上研究结果为小果油茶的分类、遗传改良、种质资源保护及进一步开发利用提供了理论依据。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．1．1 研究背景

1．1．2 研究目的和意义

1．2 国内外研究现状及评述

1．2．1 小果油茶研究现状

1．2．2 其他相关研究现状

1．3 研究目标和主要研究内容

1．3．1 研究目标

1．3．2 主要研究内容

1．3．3 经费来源

1．4 研究技术路线

第二章 小果油茶种质资源形态变异及类型划分

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 研究方法

2．1．3 数据处理

2．2 结果与分析

2．2．1 小果油茶生物学特性

2．2．2 单性状分类

2．2．3 形态特征的变异

2．2．4 表型性状的相关性分析

2．2．5 小果油茶类型划分指标选择

2．2．6 小果油茶种内自然类型的划分

2．2．7 不同小果油茶类型的形态差异

2．2．8 小果油茶优良类型选择

2．3 讨论与小结

第三章 不同小果油茶类型花粉形态及亲缘关系分析

3．1 材料和方法

3．1．1 试验材料

3．1．2 试验方法

3．2 结果与分析

3．2．1 不同类型小果油茶果实形态比较

3．2．2 不同类型小果油茶花粉形态比较

3．2．3 小果油茶果实性状与花粉粒特征指标的相关性

3．2．4 不同类型小果油茶与其近缘种间的亲缘关系分析

3．3 小结与讨论

第四章 不同小果油茶类型亲缘关系的形态学分析

4．1 材料和方法

4．1．1 材料

4．1．2 形态性状观察与测定

4．1．3 数据处理

4．2 结果与分析

4．2．1 表型性状及其赋值

4．2．2 果实性状差异

4．2．3 叶性状差异

4．2．4 花性状差异

4．2．5 基于形态学标记的聚类分析

4．3 小结与讨论

第五章 不同小果油茶类型亲缘关系的AFLP分析

5．1 材料和方法

5．1．1 材料

5．1．2 试验方法

5．1．3 数据处理

5．2 结果与分析

5．2．1 AFLP多态性分析

5．2．2 遗传相似性分析

5．2．3 基于AFLP指纹图谱的聚类分析

5．2．4 基于AFLP数据的主坐标分析

5．3 小结与讨论

第六章 油茶cDNA-AFLP技术反应体系建立的研究

6．1 材料和方法

6．1．1 材料

6．1．2 方法

6．2 结果与分析

6．2．1 油茶总RNA的质量

6．2．2 cDNA酶切及预扩增结果

6．2．3 选择性扩增结果

6．2．4 引物筛选结果

6．2．5 差异片段的回收及检测

6．3 小结与讨论

第七章 小果油茶典型类型的cDNA-AFLP分析

7．1 材料和方法

7．1．1 材料

7．1．2 方法

7．2 结果与分析

7．2．1 RNA提取结果

7．2．2 cDNA-AFLP分析

7．2．3 差异片段的回收

7．2．4 差异片段的克隆与测序

7．2．5 差异片段的序列比对

7．2．6 差异表达基因的功能分类

7．2．7 半定量RT-PCR验证

7．3 小结与讨论

第八章 结论与展望

8．1 本研究主要结论

8．2 论文创新之处

8．3 展望

参考文献

在读期间的学术研究

致谢