海南尖峰岭木本豆科植物根瘤菌多样性分析及潜在新种多相分类研究

摘要

为筛选出高效固氮的木本豆科植物根瘤菌菌株和具备多抗性的根瘤菌菌株，以充分发挥豆科植物与根瘤菌之间的共生固氮作用，保护木本豆科植物根瘤菌的种质资源，森林土壤研究室从海南尖峰岭自然保护区木本豆科植物的三个亚科二十四个种的根瘤里分离得到97株菌株。本研究通过16S rDNA序列比对，初步鉴定29株为根瘤菌。 通过革兰氏染色法、平板观察法研究了这29株根瘤菌的形态特征、生理生化特性。发现有三株菌RIF200839、RIF200888和RIF200892对实验中的七种染料都有耐受性。有五株菌RIF200837、RIF200841、RIF200842、RIF200843和RIF200859对于脱氧胆酸钠和亚硝酸钠都能耐受。在生长温度方面，所有的29株菌株都无法在60℃下生长，却都能耐受40℃的高温环境，并且，其中的16株菌株在4℃的低温环境能生长，分别为RIF200835、RIF200837、RIF200839、RIF200841、RIF200842、RIF200843、RIF200849、RIF200857、RIF200859、RIF200862、RIF200864、RIF200866、RIF200868、RIF200870、RIF200874和RIF200886。在酸碱耐受性方面，大部分的菌株都能够在pH=5～11的范围内正常生长，它们分别是RIF200814、RIF200829、RIF200835、RIF200837、RIF200839、RIF200841、RIF200842、RIF200843、RIF200845、RIF200849、RIF200853、RIF200857、RIF200859、RIF200861、RIF200864、RIF200866、RIF200868、RIF200873、 RIF200874、RIF200886、RIF200888、RIF200889和RIF200892，耐受范围广，特别是菌株RIF200859在pH=4的环境下依然能够正常生长，值得深入探究。在抗生素的抗性方面，对于选定的阿奇霉素、林可霉素和阿米卡星三类抗生素，全部菌株都表现出了很强的抗性，推测菌株应该是带有相关抗性基因的。 与此同时，对在16S rDNA上同模式菌株Rhizobium miluonense CCUAU41251T的相似度分别为98.28％和98.51％的两菌株RIF200835和RIF200845进行了新种鉴定。 通过对其进行全细胞组分的分析，包括全细胞脂肪酸组分分析和全细胞醌组分分析等的研究;还进行了持家基因atpD、glnII、recA和rpoB分析研究。发现RIF200835和 RIF200845在各种组分的分析上，都同模式菌株较为一致，仅在含量上稍有差异;。在持家基因方面的表现，两株菌之间较之于模式菌株独立成支，两个菌株之间相似性较高，并且同16S rDNA相似性最高的模式菌株Rhizobium miluonense CCUAU41251T的聚类并非最近。 综合上述抗逆性研究，筛选出了具备多抗性的菌株六株，分别是: RIF200839、RIF200841、 RIF200842、 RIF200849、 RIF200862以及RIF200866，他们对测试染料和化学药物都有较强的耐受性，都能够在4℃～40℃的温度范围内生长、pH在5到11之间，都能够生长。对几种抗生素也都表现出出色的抵抗力，属于高抗菌株。同时，菌株RIF20083和菌株RIF200845可能为根瘤菌属的新种。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 研究背景

1．3 国内外的根瘤菌研究现状

1．3．1 发现与命名

1．3．2 豆科植物根瘤菌的分类及生物多样性

1．3．3 根瘤菌系统中的命名争议

1．3．4 根瘤菌分类的研究方法

1．4 研究目标和主要研究内容

1．4．1 关键的科学问题与研究目标

1．4．2 主要研究内容

1．5 本研究的意义

1．6 研究技术路线

第二章 海南尖峰岭部分木本豆科植物根瘤菌的16S rDNA序列分析

2．1 实验采集地概况及实验材料详情

2．1．1 采集地概况

2．1．2 实验菌株的宿主植物

2．1．3 仪器设备

2．1．4 培养基及试剂

2．2 实验方法

2．2．1 根瘤的采集

2．2．2 根瘤中的根瘤菌分离和纯化

2．2．3 根瘤菌的形态特征观察

2．2．4 16S rDNA序列分析

2．3 结果与分析

2．3．1 形态特征

2．3．2 根瘤菌16S rDNA序列测定及结果分析

第三章 海南尖峰岭部分木本豆科植物根瘤菌耐受性研究

3．1．实验材料

3．2 抗逆性实验方法

3．2．1 菌株活化

3．3 结果与分析

3．3．1 抗逆性鉴定结果

第四章 海南尖峰岭木本豆科植物根瘤菌拟新种多位点序列分析

4．1 材料与方法

4．1．1 供试菌株

4．1．2 持家基因的序列分析

4．2 结果与分析

4．2．1 持家基因的分析

第五章 海南尖峰岭木本豆科植物根瘤菌拟新种细胞组分测定

5．1 材料与方法

5．1．1 供试菌株

5．1．2 电子显微镜镜检

5．1．3 拟新种菌株全细胞脂肪酸组分测定

5．1．4 拟新种全细胞醌型组分测定

5．1．5 DNA(G+C)mol％含量测定

5．2 结果与分析

5．2．1 电子显微镜观察

5．2．2 全细胞脂肪酸组分分析

5．2．3 全细胞醌组分分析

5．2．4 DNA G+C mol％含量分析

第六章 结论与讨论

5．1 结论

5．2 讨论

5．3 展望

参考文献

附录Ⅰ

附录Ⅱ

在读期间的学术研究

致谢