海南尖峰岭木本豆科植物根瘤菌资源研究

摘要

从海南尖峰岭自然保护区24种木本豆科植物的根瘤中，分离了227株菌株，这些木本豆科植物中，蝶形花亚科9属14种；苏木科3属3种；含羞草科5属7种。本研究对具有根瘤菌菌落形态特性的117株根瘤菌进行了16S rDNA鉴定，初步鉴定27株为根瘤菌，并进一步研究了这27株根瘤菌的形态特征、生理生化特性、BIOLOG碳源利用、溶磷和解钾特性；为了探讨木本豆科植物根瘤菌对不良环境的抵抗能力，本文对9株热带根瘤菌（Rhizobium tropici）菌株的温度生长范围、酸碱度耐受能力和耐盐能力做了初步研究。研究结果如下：
　　16S rDNA序列分析结果表明：木本豆科植物根瘤菌具有遗传的多样性。将16S rDNA克隆序列与GenBank的序列比对分析后，做系统发育树，发现其中的27株与目前公认的根瘤菌聚在一起：22株为热带根瘤菌（R.tropici）、1株为发根根瘤菌（Rhizobium rhizogenes）、2株为墨西哥剑菌（Ensifer mexicanum）、2株为β-变形杆菌纲的伯克霍尔德氏菌（Burkholderia sp.）；其余的90株菌株与GenBank的已知序列比对后，初步鉴定为根瘤的内生菌。27株根瘤菌的宿主不同，22株热带根瘤菌的宿主分别为长眉红豆、葫芦茶、假地豆、野青树、荔枝叶红豆和马占相思；1株发根根瘤菌分离自格木；2株墨西哥剑菌分离自墨西哥丁香；2株伯克霍尔德氏菌分离自藤黄檀。热带根瘤菌的菌株间16S rDNA的相似性也有差异：caf443与caf436的16S rDNA相似度最低仅为98.8％，其他菌株间的相似度不同，但均在99.0%以上。
　　生理生化实验结果发现：其聚类结果和16S rDNA序列聚类结果基本吻合。表现为发根根瘤菌caf448与参比菌株发根根瘤菌、墨西哥剑菌caf249和caf254与同属的费氏中华根瘤菌、伯克霍尔德氏菌caf420和caf421与洋葱伯克霍尔德氏菌分别聚在一起。22株热带根瘤菌与参比菌株热带根瘤菌、新疆中华根瘤菌聚为一群，但菌株间的生理生化特性有较大差异。
　　根瘤菌间碳源利用能力有差异，95种碳源中供试根瘤菌均可以利用有戊五糖、L-阿拉伯糖和α-D-葡萄糖，均不能利用的有α-环式糊精和肝糖。BIOLOG聚类结果与生理生化的聚类结果不同，表现为墨西哥剑菌caf249与热带根瘤菌聚为一群，而与同一属的费氏中华根瘤菌的聚类较远。
　　溶磷的结果表明：尖峰岭地区的根瘤菌具有较强的溶磷能力。24株根瘤菌表现出较强的溶磷能力，均能溶解无机磷Ca3(PO4)2，所有菌株均不能溶解有机磷。在PKO无机磷培养基平板上caf446的D/d比值最大为2.037，D/d大于1.5的还有caf415(1.854)、caf437(1.570)、caf226(1.529)、caf276(1.880)、caf278(1.610)、caf334(1.678)、caf341(1.630)、caf344(1.596)、caf414(1.611)、caf420(1.543)和caf436(1.743)。磷钼锑抗比色法测定D/d大于1.0的根瘤菌液体培养基中全磷的含量发现：除caf438外其余的菌株的有效磷含量均高于对照（CK），caf341的有效磷含量最高为629.63mg/kg，caf436、caf276、caf444、caf278、caf336和caf344的含量均在400mg/kg以上。
　　解钾的结果表明：根瘤菌的培养液中的可溶性钾的含量显著高于对照，caf224(1.617)、caf416(1.605)、caf420(1.498)、caf278(1.459)、caf440(1.466)、caf341(1.478)、caf344(1.497)、caf414(1.572)和caf415(1.532)可溶性钾含量高于标准菌株CGMCC1.2540(1.445)。
　　综合分析同时具有溶磷和解钾能力的菌株有23株：caf224、caf225、caf226、caf414、caf415、caf416、caf341、caf344、caf333、caf334、caf336、caf276、caf278、caf279、caf437、caf438、caf439、caf440、caf443、caf444、caf446、caf436和caf420。其中溶磷解钾能力均较强的有caf278、caf341、caf344、caf414、caf420。
　　热带根瘤菌的抗逆性研究发现：热带根瘤菌（R.tropici）的pH生长范围宽，均可耐受pH4-11，caf224和caf276耐酸能力更强可以耐受pH3；耐盐能力强，均可以耐受2%的NaCl，caf226耐盐能力更强可以耐受含4%NaCl的培养基；温度适应性强，所有菌株在20-37℃的培养环境中生长良好，3株菌株caf224、caf414、caf336可以在10℃生长，6株菌株caf224、caf226、caf414、caf415、caf438、caf276可以耐受45℃的高温，而且供试菌株对短时间的高温有耐受性，caf414、caf276可以耐受50℃20min高温刺激，caf224、caf226、caf415、caf416、caf438、caf279可以耐受60℃10min的短时高温刺激。
　　综上所述：海南尖峰岭自然保护区木本豆科植物根瘤菌呈现出遗传多样性和表形多样性，其16S rDNA序列、生理生化特性和碳源利用均表现出多样性。对功能菌株的研究结果分析发现根瘤菌具有既溶磷又能解钾的特性，得到了23株具有溶磷和解钾功能的根瘤菌，其中4株为能溶磷和解钾且具有多种抗逆性的功能性热带根瘤菌菌株：caf224、caf226、caf276和caf414。

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表目录

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第一章 绪论

1.1 引言

1.2 研究背景

1.3 国内外研究现状及评述

1.4 海南尖峰岭木本豆科植物

1.5 研究目标和主要研究内容

1.6 本研究的意义

1.7 研究技术路线

第二章 木本豆科植物根瘤菌的分离与鉴定

2.1 采样地概况及试验材料

2.2 试验方法

2.3 结果与分析

2.4 小结

第三章 根瘤菌溶磷、解钾功能菌株的筛选

3.1 试验材料

3.2 试验方法

3.3 结果与分析

3.4 小结

第四章 热带根瘤菌抗逆性功能菌株的筛选

4.1 试验材料

4.2 热带根瘤菌抗逆性的研究方法

4.3 实验结果与分析

4.4 小结

第五章 结论与讨论

5.1 结论

5.2 讨论

5.3 展望

参考文献

附录

在读期间的学术研究

致谢