毛竹AP2/ERF基因家族分析及DREB类转录因子表达研究

摘要

毛竹（Phyllostachys edulis）是一个快速生长的非木质森林物种，是亚洲所有竹类植物中经济价值、生态价值和社会价值极高的竹种之一。AP2/ERF转录因子家族为植物特有的、家族成员数众多的家族，在调节植物的生长发育和响应生物与非生物胁迫过程中发挥着非常重要的作用。本论文在毛竹基因组草图数据库的基础上，对毛竹AP2/ERF转录因子家族进行了生物信息学分析，研究了DREB亚家族因子基因在不同非生物逆境胁迫下的表达差异，同时分离了两个DREB基因并对其功能进行了验证。主要研究结果如下:
　　(1)本研究共确定了116个毛竹AP2/ERF转录因子。进化关系分析结果显示，这116个转录因子可被划分为3个亚家族:AP2，RAV和ERF，其中ERF亚家族转录因子又被划分为11个Group。对毛竹AP2/ERF基因的结构、内含子/外显子结构和保守基序皆进行了分析，结果表明不同亚家族和Group基因具有不同的结构特征。研究毛竹AP2/ERF基因的进化模式和分离时间发现毛竹AP2/ERF基因约在1500万年前发生了一次大规模复制事件，在1500-2300万年前毛竹和水稻的AP2/ERF基因发生了分离事件。通过对毛竹DREB亚家族基因的上游启动子区域分析，发现毛竹亚家族DREB基因的上游启动子区域存在大量与胁迫响应相关的顺式作用元件。
　　(2)对毛竹DREB基因的表达模式分析，结果显示大多数基因在根中响应干旱、低温或盐胁迫而被强烈诱导表达，相反，叶片中大部分基因响应这三种胁迫而发挥下调表达的作用。研究发现毛竹DREB亚家族基因可能存在两个特点:一是其成员数少于水稻和拟南芥成员数，二是在响应非生物胁迫过程中其在根与叶片中的表达模式不同。
　　(3)从毛竹中克隆了两个DREB基因，PeDREB2A和PeDREB1A（基因ID:PH01000046G1730和PH01000668G0350），基因序列CDS长度分别为795 bp和825 bp。这2个基因各包含一个典型的AP2/ERF结构域，分子量大小分别为28.96 kDa和28.84kDa，等电点分别为9.47和5.34。RT-PCR分析显示PeDREB2A和PeDREB1A基因具有组织表达特异性，在根茎叶中均差异表达且在叶片和茎中的表达量相近。应用qRT-PCR方法分析显示，在叶片中，PeDREB2A转录产物在干旱和盐处理下迅速积累，分别在12h和0.5 h时达到最大值，但在低温胁迫处理下表达量较低;PeDREB1A基因被低温诱导强烈上调表达，在3h时达到最大值，而在干旱和盐胁迫下表达水平低。在根中，PeDREB2A基因在干旱、低温和盐胁迫下下调表达，PeDREB1A基因表达量在三种胁迫处理下呈先上升后下降的趋势。
　　(4)超表达PeDREB2A或PeDREB1A基因的转基因拟南芥在低温和盐胁迫培养基中表现出一定的耐寒和耐盐特征，低温处理下，转基因植株的叶片仍保持绿色，盐处理下，转基因种子发芽速度快，侧根数增多等。
　　本研究为毛竹抗逆分子机理的研究提供了理论依据，研究结果将有助于克服毛竹栽培过程中的挑战。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 研究背景

1．2 国内外研究现状

1．2．1 转录因子简介

1．2．2 植物转录因子的结构

1．2．3 植物转录因子的分类及其调控

1．2．4 AP2／ERF转录因子

1．3 研究目标和主要研究内容

1．3．1 关键的科学问题与研究目标

1．3．2 主要研究内容

1．4 项目来源和经费支持

1．5 技术路线

第二章 毛竹AP2／ERF家族转录因子生物信息学分析

2．1 分析方法

2．1．1 毛竹AP2／ERF转录因子鉴定

2．1．2 毛竹AP2／ERF转录因子家族基因进化关系、基序和结构分析

2．1．3 水稻和毛竹AP2／ERF家族基因的进化模式和分离时间分析

2．1．4 毛竹DREB亚家族基因潜在启动子区域分析

2．2 结果

2．2．1 毛竹AP2／ERF转录因子的鉴定

2．2．2 毛竹AP2／ERF转录因子家族基因进化关系分析

2．2．3 毛竹AP2／ERF转录因子家族基因结构和保守基序分析

2．2．4 毛竹AP2／ERF家族各Group的鉴定

2．2．5 毛竹AP2／ERF转录因子家族基因进化模式及分离时间分析

2．2．6 毛竹DREB亚家族基因潜在启动子区域分析

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 毛竹DREB亚家族基因表达模式分析

3．1 材料与方法

3．1．1 植物材料

3．1．2 TRIZOL法提取总RNA及cDNA第一链的合成

3．1．3 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 小结

第四章 毛竹PeDREB2A和PeDREB1A基因的克隆及功能验证

4．1 材料与方法

4．1．1 植物材料

4．1．2 目的基因克隆及转化

4．1．3 目的基因生物信息学分析

4．1．4 目的基因组织特异性表达检测

4．1．5 目的基因胁迫响应表达模式分析

4．1．6 植物表达载体的构建

4．1．7 转基因植株转化

4．1．8 转基因植株筛选

4．1．9 转基因拟南芥植株检测

4．1．10 T3代转基因拟南芥纯合体植株筛选

4．1．11 模拟干旱胁迫筛选抗旱转基因拟南芥株系

4．1．12 盐胁迫筛选抗盐转基因拟南芥株系

4．1．13 低温胁迫筛选抗寒转基因拟南芥株系

4．2 结果

4．2．1 目的基因的克隆

4．2．2 目的基因的生物信息学分析

4．2．3 目的基因的组织特异性表达检测

4．2．4 干旱处理下PeDREB2A和PeDREB1A基因表达的变化

4．2．5 低温处理下PeDREB2A和PeDREB1A基因表达的变化

4．2．6 盐处理下PeDREB2A和PeDREB1A基因表达的变化

4．2．7 PeDREB2A和PeDREB1A过表达载体的构建

4．2．8 转基因拟南芥纯合体株系的筛选

4．2．9 转基因拟南芥胁迫响应功能验证

4．3 讨论

4．4 小结

第五章 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

附录

在读期间的学术研究

致谢