百脉根AP2/ERF转录因子及其编码基因和应用

摘要

本发明公开了百脉根AP2/ERF转录因子及其编码基因和应用，属于AP2/ERF转录因子及应用领域。本发明首先公开了从百脉根中分离的AP2/ERF转录因子基因，其核苷酸序列为SEQ？ID？NO.1所示，所编码蛋白的氨基酸序列为SEQ？ID？NO.2所示。本发明还公开了能够与顺式作用元件结合而启动抗逆应答基因表达的AP2/ERF转录因子结构域，其氨基酸序列为SEQ？ID？NO.3所示。功能转化实验证明，在植物中过表达AP2/ERF转录因子基因能够显著提高转基因植株的耐盐性，说明其所编码蛋白具有AP2/ERF转录因子的功能。本发明AP2/ERF转录因子基因在提高植物对逆境胁迫的抗性中有重要应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及转录因子，尤其涉及一种从百脉根(LotuscorniculatusL.)中分离的与抗逆相关的AP2/ERF转录因子，本发明还涉及所述转录因子在提高植物抗逆境胁迫中的应用，属于AP2/ERF转录因子及其应用领域。

背景技术

土壤盐碱化和次生盐碱化问题在世界范围内广泛存在，特别是干旱、半干旱地区更为严重。土壤干旱、盐碱化严重阻碍了农作物的生长，降低了农作物的产量，已经成为制约世界灌溉农业可持续发展和影响生态环境的重要因素。

百脉根(LotuscorniculatusL.)是世界范围内广泛种植的多年生优良豆科牧草，具有营养丰富、耐贫瘠、耐酸碱、耐牧和饲用安全、适口性好等优点。其不仅是建设生态农业的优质草种，还是用于土壤改良的重要作物，在用作地被植物、保持水土、改良人工草场、防止土壤荒漠化等方面具有独特作用。

植物抗逆性是受多基因控制的复杂数量性状，单个基因表达的增强并不能从根本上改良植物对多种不良环境的抵抗能力，而转录因子(TranscriptionalFactors,TFs)是能够与真核生物基因启动子区域中顺式作用元件特异性结合，从而激活或抑制下游基因在特定时间和空间转录与表达的一类DNA结合蛋白，是目前抗逆研究最多、应用最广的一类基因。

植物逆境抗性相关转录因子可以分：AP2/ERF、bZIP、WRKY、MYB、NAC五大类。其中AP2/ERF转录因子是植物特有的一大类超基因家族，具有非常保守的DNA结合域，特异性的与ERE、GCC-box等顺式元件结合，调控胁迫应答基因表达，是参与植物生长发育、生物/非生物胁迫应答基因表达及信号转导的重要转录调控因子。AP2/ERF超家族分为AP2、DREB、ERF、RAV和Soloist共5个亚家族，目前已有大量文献报道了DREB和ERF亚家族基因的功能与分子机制研究，但是有关单独亚家族(Soloist)文献报道还很少。因此，从优良豆科牧草百脉根中分离、鉴定AP2/ERF转录因子并分析其抗逆功能，对于农牧业生产、生态环境建设、土壤改良等方面均具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供从百脉根(LotuscorniculatusL.)中分离的AP2/ERF转录因子及其编码基因；

本发明所要解决的另一个技术问题是提供含有上述编码基因的重组植物表达载体及含有该表达载体的宿主细胞；

本发明所要解决的第三个技术问题是将所述AP2/ERF转录因子及其编码基因应用于提高植物对逆境胁迫的抗性。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先公开了从百脉根(LotuscorniculatusL.)中分离的AP2/ERF转录因子编码基因(命名为：LcAP2/ERF107)，其多核苷酸为(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所示：

(a)、SEQIDNO.1所示的多核苷酸；或

(b)、编码SEQIDNO.2所示氨基酸的多核苷酸；或

(c)、与SEQIDNO.1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸所编码蛋白质仍具有AP2/ERF转录因子功能；或

(d)、与SEQIDNO.1所示的多核苷酸至少有90％或以上同源性的多核苷酸；或

(e)、在SEQIDNO.1所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有AP2/ERF转录因子的功能或活性。

本发明上述LcAP2/ERF107转录因子编码基因编码的AP2/ERF转录因子，其氨基酸为(a)或(b)所示：

(a)、SEQIDNO.2所示的氨基酸；

(b)、将SEQIDNO.2所示的氨基酸通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有AP2/ERF转录因子功能或活性的蛋白变体。

其中，SEQIDNO.2的氨基端第108至159位氨基酸残基序列为AP2/ERF结合域的编码序列(SEQIDNO.3所示)，该结合域第14位(第121位)氨基酸为丙氨酸(A)，第19位(第126位)氨基酸为天冬氨酸(D)，此类结构域能够与GCCbox顺式作用元件结合而启动抗病防卫基因或抗逆应答基因的表达。

本发明所述的蛋白变体可由遗传多态性或人为操作产生，这些操作方法通常为本领域所了解。例如，可通过DNA的突变来制备AP2/ERF转录因子的氨基酸序列变体或片段，其中用于诱变或改变多核苷酸的方法为本领域所习知。其中，保守的取代是将一种氨基酸残基替换成具有相似性质的另一种氨基酸。

本发明所述的LcAP2/ERF107转录因子编码基因包括天然存在的序列和变体两种形式。“变体”意指基本相似的序列，对于多核苷酸，变体包含天然多核苷酸中一个或多个位点处一个或多个核苷酸的缺失、插入或/和替换。对于多核苷酸，保守的变体包括由于遗传密码的简并性而不改变编码的氨基酸序列的那些变体。诸如此类天然存在的变体可通过现有的分子生物学技术来鉴定。变体多核苷酸还包括合成来源的多核苷酸，例如采用定点诱变所得到的仍编码SEQIDNO.2所示的氨基酸的多核苷酸变体，或者是通过重组的方法(例如DNA改组)。本领域技术人员可通过以下分子生物技术手段来筛选或评价变体多核苷酸所编码蛋白的功能或活性：DNA结合活性、蛋白之间的相互作用，瞬时研究中基因表达的激活情况或转基因植物中表达的效应等。

本发明将SEQIDNO.2所示的氨基酸(LcAP2/ERF107转录因子)与拟南芥、水稻的同源AP2/ERF的氨基酸序列进行多序列比对，构建进化树，结果表明LcAP2/ERF107与拟南芥单独亚家族(Soloist)的At4g13040同源关系最近。因此，LcAP2/ERF107是单独亚家族的新基因。

本发明还公开了含有所述LcAP2/ERF107转录因子编码基因的重组表达载体以及含有所述重组表达载体的重组宿主细胞；其中，所述重组表达载体是重组植物表达载体。

将所述LcAP2/ERF107转录因子编码基因可操作的与表达调控元件相连接，得到可以在植物中表达该编码基因的重组植物表达载体；该重组植物表达载体可以由5′端非编码区，SEQIDNO.1所示的核苷酸和3′非编码区组成；其中，所述的5′端非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子可以是组成性启动子、诱导型启动子、组织或器官特异性启动子；所述的3′非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等。合适的终止子序列可取自根癌农杆菌的Ti-质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。

另外，本领域技术人员可以将SEQIDNO.1所示的核苷酸进行优化以增强在植物中的表达效率。例如，可采用目标植物的偏爱密码子进行优化来合成多核苷酸以增强在目标植物中的表达效率。

所述重组植物表达载体还可含有用于选择转化细胞的选择性标记基因，用于选择经转化的细胞或组织。标记基因包括：编码抗生素抗性的基因以及赋予除草化合物抗性的基因等。此外，所述的标记基因还包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白等。

本发明还涉及将所述的LcAP2/ERF107转录因子编码基因引入到植物中以提高植物对逆境胁迫的抗性。

本发明公开了一种提高植物对逆境胁迫抗性的方法，包括以下步骤：(1)构建含有从百脉根中分离的LcAP2/ERF107转录因子编码基因的重组植物表达载体；(2)将所构建的重组植物表达载体转化到植物或植物细胞中；(3)培育筛选得到对逆境胁迫抗性提高的转基因植物。

本发明还公开了一种培育耐逆境胁迫的转基因植物新品种的方法，包括以下步骤：(1)构建含有从百脉根中分离的LcAP2/ERF107转录因子编码基因的重组植物表达载体；(2)将所构建的重组植物表达载体转化到植物或植物细胞中；(3)培育筛选得到对逆境胁迫抗性提高的转基因植物新品种。

其中，所述的逆境胁迫包括：高盐、干旱或低温。

转化方案以及将所述多核苷酸或多肽引入植物的方案可视用于转化的植物(单子叶植物或双子叶植物)或植物细胞的类型而变化。将所述多核苷酸或多肽引入植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化、直接基因转移以及高速弹道轰击等。在特定的实施方案中，可利用多种瞬时转化法将本发明的LcAP2/ERF107转录因子编码基因提供给植物。在其它实施方案中，本发明的LcAP2/ERF107转录因子编码基因可通过将植物与病毒或病毒核酸接触来引入到植物中，通常，这样的方法涉及将本发明的LcAP2/ERF107转录因子编码基因构建体引入病毒DNA或RNA分子中。

利用常规方法可使已转化的细胞再生稳定转化植株(McCormicketal.PlantCellReports.1986.5:81-84)。本发明可用于转化任何植物种类，包括但不限于：单子叶植物或双子叶植物。更优选的，所述的目标植物包括农作物、蔬菜或观赏植物、果树等，例如，可以是玉米、水稻、高粱、小麦、大豆、马铃薯、大麦、番茄、菜豆、花生或甘蔗等。

为了分析本发明从百脉根(LotuscorniculatusL.)中分离的LcAP2/ERF107转录因子的功能，本发明首先构建了含有LcAP2/ERF107转录因子编码基因(核苷酸为SEQIDNO.1所示)的重组植物高效表达载体，利用农杆菌介导法将其转化到拟南芥中，通过潮霉素抗性筛选、PCR及RT-PCR鉴定获得阳性植株。通过测定转基因拟南芥在盐胁迫下的发芽率、存活率以及转基因拟南芥在盐胁迫条件下的生理生化指标表明，转基因LcAP2/ERF107拟南芥种子在高盐胁迫下的发芽率极显著的高于野生型；在高盐持续胁迫下，转基因拟南芥幼苗的存活率显著高于野生型，说明转录因子LcAP2/ERF107显著提高了转基因植株的耐盐性。生理生化指标测定表明，转基因LcAP2/ERF107拟南芥是通过提高相对含水量和降低细胞膜的损伤程度提高耐盐性的。因此，转录因子LcAP2/ERF107是百脉根AP2/ERF家族中优良的耐盐调控因子。

功能转化实验证明，在植物中过表达LcAP2/ERF107转录因子编码基因能够有效提高或改善植物对包括高盐、干旱、低温等逆境胁迫的抗性，在提高植物抗逆反应中起着重要作用，说明LcAP2/ERF107基因所编码的蛋白具有AP2/ERF转录因子的功能。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明从百脉根中分离、鉴定了一个单独亚家族基因LcAP2/ERF107，对其进行抗逆功能分析表明，该基因显著提高了转基因拟南芥的耐盐性，是百脉根中优良的抗逆转录因子，为百脉根或其他豆科牧草抗逆分子改良与育种提供基因资源与技术支持，对于农牧业生产、生态环境建设以及土壤改良等具有重要意义。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“转录因子”意指能够与真核生物基因启动子区域中顺式作用元件特异性结合，从而激活或抑制下游基因在特定时间和空间转录与表达的一类DNA结合蛋白。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,NucleicAcidRes.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,MolCell.Probes8:91-98(1994))。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。

述语“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍)。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(Tijssen,TechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicProbes,"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(Tm)约5-10℃。Tm为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在Tm下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在pH7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1％SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。

本发明中所述的“多个”通常意味着2-8个，优选为2-4个，这取决于AP2/ERF转录因子三维结构中氨基酸残基的位置或氨基酸的种类；所述的“替换”是指分别用不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基；所述的“缺失”是指氨基酸残基数量的减少，也即是分别缺少其中的一个或多个氨基酸残基；所述的“插入”是指氨基酸残基序列的改变，相对天然分子而言，所述改变导致添加一个或多个氨基酸残基。

术语“重组宿主细胞株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，宿主细胞还可为单子叶或双子叶植物细胞。

术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。

术语“转化”指将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。

术语“表达”指内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。

术语“编码序列”指转录成RNA的核酸序列。

术语“重组植物表达载体”意指一种或多种用于实现植物转化的DNA载体；本领域中这些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌介导转化的。二元载体通常包括：T-DNA转移所需要的顺式作用序列、经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的选择标记物，待转录的异源性DNA序列等。

附图说明

图1为LcAP2/ERF107CDS全长序列的扩增结果；

图2为转录因子LcAP2/ERF107结构保守域分析；

图3为转录因子LcAP2/ERF107的系统进化分析；

图4为LcAP2/ERF107的组织表达分析；

图5为LcAP2/ERF107在不同胁迫条件下的表达模式分析；

图6为植物表达载体pH7WG2D-LcAP2/ERF107构建流程图；其中，A：入门载体构建；B：植物过表达载体构建；

图7为重组质粒pH7WG2D-LcAP2/ERF107的PCR鉴定结果；

图8为含有表达载体pH7WG2D-LcAP2/ERF107的农杆菌GV3101的菌落PCR；

图9为转LcAP2/ERF107基因拟南芥的DNA水平的PCR检测结果；

图10为转LcAP2/ERF107基因拟南芥的RNA水平的PCR检测；其中，L8、L13、L15为转基因LcAP2/ERF107拟南芥的不同株系；

图11为盐胁迫下转基因LcAP2/ERF107拟南芥种子发芽率；其中，CK为野生型拟南芥；L8、L13、L15为转基因LcAP2/ERF107拟南芥的不同株系；

图12为盐胁迫对转基因LcAP2/ERF107拟南芥幼苗存活率的影响；其中，WT为野生型拟南芥；L8、L13、L15为转基因LcAP2/ERF107拟南芥的不同株系；

图13为盐胁迫对转基因LcAP2/ERF107拟南芥生理指标的影响；其中，A：相对含水量；B：相对电导率；WT为野生型拟南芥；L8、L13、L15为转基因LcAP2/ERF107拟南芥的不同株系。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1百脉根LcAP2/ERF107转录因子编码基因的分离、鉴定与克隆

1材料与方法

1.1材料

1.1.1植物材料培养及胁迫处理

以百脉根‘Leo’为材料，选成熟饱满、无病虫害的种子，用2％NaClO浸泡15-20min，无菌水冲洗3次，晾干，把消过毒的种子置于B5培养基上，光照培养箱中培养30天，用150mM的氯化钠处理0h、3h、12h、24h，采集叶片立即液氮速冻，保存于-80℃冰箱中备用。

组织表达特异性分析：取大田百脉根的根、茎、叶、花、种子，液氮速冻，-80℃保存待用。

激素处理百脉根，将培养30d的幼苗移栽至含有100μM的ABA、ACC、MeJA、SA的MS培养基中，处理0h、3h、12h、24h，取嫩叶，液氮速冻，-80℃保存待用。

1.1.2菌株与质粒

大肠杆菌(Escherichiacoli)：DH5α本发明人实验室保存；

pEASY-T-Simple克隆载体购自全式金生物公司。

1.1.3溶液

(1)TE(10mMTris-HCl，pH8.0；1mMEDTA，pH8.0)的配制：

1MTris-HCl(pH8.0)1ml，0.5MEDTA(pH8.0)0.2ml，超纯水至100ml。

(2)50×TAE缓冲液：242gTris碱，57.1ml冰醋酸，100ml0.05mol/LEDTA(pH8.0)

(3)1.0MTris-HCl缓冲液(1L)：800ml去离子水中溶解121.1gTris碱，充分溶解后，加入浓HCL40ml，用去离子水定容至1L。

1.1.4培养基

(1)LB液体培养基(1L,pH7.4)：

蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g,NaCl10.0g。如是固体培养基，添加琼脂粉15.0-20.0g。

(2)B5培养基(pH5.8)：B5干粉4.43g，蔗糖20g，溶于800mL去离子水中，调pH值至5.8-6.0，定容至1L，固体培养基中加入15g琼脂粉或2.5g植物凝胶，121℃高温高压灭菌15min。如果配制含有抗生素或激素培养基，将灭完菌的B5培养基冷却到60℃左右，再加入相应的试剂到所需浓度。

1.2实验方法

1.2.1百脉根总RNA的提取

参照天根生化公司的多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明书(目录号：DP441)。

1.2.2第一链cDNA的合成

参照北京全式金生物技术有限公司的反转录试剂盒(gDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix)说明书。

1.2.3LcAP2/ERF107转录因子cDNA的克隆

(1)引物的设计与合成

克隆LcAP2/ERF107CDS全长的引物序列见表1。

表1克隆LcAP2/ERF107CDS全长的引物序列

(2)RT-PCR

以用150mMNaCl处理12h、24h的叶片为材料提取总RNA，以反转录的cDNA为模板进行RT-PCR，PCR条件为：94℃5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃保存。

(3)PCR产物的回收

采用北京全式金生物技术有限公司的EasypurePCRPurificationkit回收目的片段，按照试剂盒说明书的方法进行操作。

(4)目的片段与克隆载体的连接

将回收的PCR产物连接至pEASY-T-Simple载体上，连接反应体系如表2，25℃连接10min。

表2连接反应体系

(5)大肠杆菌感受态的制备

参照文献“One-steppreparationofcompetentEscherichiacoli:transformationandstorageofbacterialcellsinthesamesolution”(Chungetal.,1989)中所写的具体方法进行。

(6)大肠杆菌的转化(热激法)

参照《分子克隆实验指南》(第三版，J.萨姆布鲁克)一书中所列的具体方法进行。

(7)菌落PCR鉴定

以含有Kan的LB平板上挑取的白色单菌落，进行菌落培养并PCR验证，采用通用引物M13，扩增条件为：94℃3min，(94℃45sec，55℃45sec，72℃1min)30个循环，72℃10min。反应结束后，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，并将筛选得到阳性克隆送中国农业科学院作物科学研究所重大工程开放实验室测序部测序。

1.2.4基因LcAP2/ERF107在不同胁迫条件下的表达模式分析

采用RT-PCR方法分析基因LcAP2/ERF107在根、茎、叶、花和种子中的组织表达特异性。

取大田百脉根的根、茎、叶、花、种子，液氮速冻，-80℃保存待用，提取总RNA的具体步骤参照天根生化公司的多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明书(离心柱型，目录号：DP441)，采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计(BiodropsisBD-2000)检测提取的RNA质量和纯度。cDNA的合成参照北京全式金生物技术有限公司的反转录试剂盒(gDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix)说明书。以cDNA为模板，引物为基因LcERFs特异引物，进行RT-PCR，PCR产物用2％的琼脂糖胶电泳，RT-PCR产物为139bp的泛素蛋白基因polyubiquitin(AW720576)作为对照。

表3RT-PCR或qPCR的特异引物序列

采用qRT-PCR方法分析基因LcAP2/ERF107受激素(ABA、ACC、MeJA、SA)和非生物胁迫(NaCl)诱导不同时间的表达量变化情况。

用100μMABA、ACC、JA、SA，150mMNaCl分别处理30日龄的百脉根幼苗0h、3h、12h和24h，取嫩叶，液氮速冻，按照上述方法提取总RNA，反转录第一条链cDNA，采用qRT-PCR分析盐胁迫应答基因的相对表达量，百脉根泛素蛋白基因polyubiquitin(AW720576)作为内参基因。qRT-PCR的反应体系，参考北京全式金生物技术有限公司的定量PCR试剂盒(GreenqPCRSuperMix,货号：AQ131)，具体见表4和5。在进行qRT-PCR时，每个样品重复三次实验，三个技术重复，采用2^-ΔΔCT方法(LivakandSchmittgen,2001)计算基因的相对表达量。

表4qRT-PCR反应体系

表5qRT-PCR扩增程序

2实验结果与分析

2.1LcAP2/ERF107基因的克隆及其生物信息学分析

本发明以用150mMNaCl处理24h的30日龄的百脉根幼苗为材料，提取叶片总RNA并反转录为cDNA，采用表1的基因全长引物，RT-PCR扩增出了LcAP2/ERF107基因完整的ORF序列(SEQIDNO.1所示)，结果见图1，并提交Genbank，获得登录号：KC357712。基因LcAP2/ERF107的开放阅读框为699bp，编码232个氨基酸(SEQIDNO.2所示)。采用SMART软件分析转录因子LcAP2/ERF107的保守结构域，第108至159位氨基酸残基序列为AP2/ERF结合域的编码序列(SEQIDNO.3所示)，结果见图2，该结合域第14位氨基酸为丙氨酸(A)，第19位氨基酸为天冬氨酸(D)，此类结构域能够与GCCbox顺式作用元件结合而启动抗病防卫基因或抗逆应答基因的表达。

通过ExPASyComputepI/Mwtool软件预测蛋白LcAP2/ERF107等电点为9.62，分子量为24.8kDa；采用SignalP4.1软件分析信号肽，结果显示：LcAP2/ERF107蛋白没有信号肽，属于非分泌性蛋白；ProtScale软件分析疏水性、TMHMM软件分析跨膜结构，结果表明：LcAP2/ERF107蛋白是亲水蛋白，且没有跨膜结构。采用Motifscan软件分析，结果表明，14-18和68-77是丝氨酸(ser)富集区域，162-167是酸性氨基酸富集区，其可能在转录激活中发挥重要作用。

采用ClustalX2软件将LcAP2/ERF107与拟南芥、水稻的同源AP2/ERF的氨基酸序列进行多序列比对，用MEGA5.0构建进化树，见图3，LcAP2/ERF107与拟南芥单独亚家族(Soloist)的At4g13040同源关系最近，因此LcAP2/ERF107是单独亚家族的新基因。

2.2基因LcAP2/ERF107在不同胁迫条件下的表达模式分析

采用RT-PCR方法分析了基因LcAP2/ERF107在根、茎、叶、花和种子中的组织表达特异性，如图4所示，该基因在根、茎、叶、花、种子组织中都表达。

采用qRT-PCR方法分析了基因LcAP2/ERF107受激素(ABA、ACC、MeJA、SA)和非生物胁迫(NaCl)诱导不同时间的表达量变化情况，结果见图5。基因LcAP2/ERF107受NaCl处理3h和24h，表达量上调2倍左右，说明受NaCl持续诱导表达；ABA、ACC、JA和SA诱导3h，表达量变化不显著，诱导24h，表达量显著上调，说明LcAP2/ERF107受四大激素ABA、ACC、JA和SA后期诱导表达，因此，基因LcAP2/ERF107受ABA、ACC、JA、SA、NaCl诱导表达。由此看出，LcAP2/ERF107对盐非生物胁迫和脱落酸、乙烯、茉莉酸、水杨酸等激素处理都有不同程度的应答，说明它可能参与了多种非生物胁迫及信号转导途径。

实施例2含有LcAP2/ERF107基因的植物表达载体的构建及其在拟南芥中的耐盐功能验证

1材料与方法

1.1材料

1.1.1植物材料

拟南芥(Arabidopsisthaliana)哥伦比亚Columbia(Col-0)生态型：本发明人实验室保存。

1.1.2菌种及载体

根癌农杆菌菌株GV3101，本发明人实验室保存；gateway入门载体pDNOR201、表达载体pH7WG2D购自invitrogen公司。

1.1.3培养基

(1)YEB培养基(1L)

蛋白胨5g，酵母提取物1g，蔗糖5g，MgSO₄·7H₂O0.5g，去离子水定容至1L，若是固体培养基，加入15g琼脂粉，121℃高温高压灭菌15min。

(2)LB培养基(1L)

胰蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母提取物5g，去离子水定容至1L，若是固体培养基，加入15g琼脂粉，121℃高温高压灭菌15min。

(3)MS培养基

MS干粉4.43g，蔗糖20g，溶于800mL去离子水中，调pH值至5.8-6.0，定容至1L，固体培养基中加入15g琼脂粉或2.5g植物凝胶，121℃高温高压灭菌15min。如果配制含有抗生素或激素培养基，将灭完菌的MS培养基冷却到60℃左右，再加入相应的试剂到所需浓度。

1.2实验方法

1.2.1引物设计与合成

设计合成含有attb位点的引物，序列见表6。

表6构建植物表达载体所用引物

1.2.2植物表达载体的构建

(1)植物高效表达载体pH7WG2D-LcAP2/ERF107的构建

利用引物LcAP2/ERF107-attb(F)和LcAP2/ERF107-attb(R)从实施例1连接有基因LcAP2/ERF107的CDS全长的pEASY-T载体上扩增出含有attb位点的完整开放阅读框(SEQIDNO.1所示)。扩增产物和入门载体pDNOR201经BP反应，将pDNOR201载体上的CCDB基因替换为LcAP2/ERF107基因，构建含有目的基因LcAP2/ERF107的入门载体，转化大肠杆菌DH5α，PCR扩增筛选重组质粒，并测序鉴定。将经测序正确的入门载体pDNOR201-LcAP2/ERF107与表达载体pH7WG2D进行LR反应，将表达载体上的CCDB基因替换为目的基因LcAP2/ERF107，构建植物表达载体pH7WG2D-LcAP2/ERF107，转化大肠杆菌DH5α，PCR扩增鉴定重组质粒。

(2)重组质粒的小量提取

质粒提取方法参照百泰克质粒小量制备试剂盒所列的具体方法。

1.2.3农杆菌转化及培养

(1)农杆菌GV3101感受态细胞的制备，采用TSS法，具体方法同大肠杆菌感受态制备。转化方法采用热激法，具体步骤参见精编分子生物学实验指南(奥斯伯)。

(2)含有重组质粒的农杆菌的PCR鉴定

分别挑取28℃培养1-2d的YEB(含50mg/LSpe,50mg/LRif)转化平板上的单菌落，以未转化的农杆菌作阴性对照，以植物表达载体质粒pH7WG2D-LcAP2/ERF107为阳性对照，进行菌落PCR鉴定。

1.2.4拟南芥的遗传转化

侵染花序法转化拟南芥。

将含有植物表达载体pH7WG2D-LcAP2/ERF107的农杆菌培养至OD₆₀₀为0.8-2.0，5500rpm离心10-15min，弃上清，菌体沉淀用MS渗透液重悬，调整OD₆₀₀为0.8-1.2，侵染拟南芥用。

4周左右的拟南芥抽薹后，从基部剪掉主茎，促使侧茎生长约一周，花蕾饱满且处于露白期时，采用蘸花法(CloughandBent，1998)转化拟南芥，花序在上述渗透液中浸泡15sec-45sec，倾斜放置，暗培养2-3d后，正常培养一周，再重复侵染拟南芥一次，四周后收获成熟的种子。

1.2.5转基因LcAP2/ERF107拟南芥的筛选与鉴定

(1)转LcAP2/ERF107基因拟南芥的抗性筛选

将收获的T₀代种子，无菌操作铺在含有25mg/L潮霉素的MS平板上，长出T₁代转基因阳性植株，正常培养，收获单株种子；选取50粒种子T₁代种子铺在潮霉素抗性平板上，长出T₂代转基因阳性植株，选择阳性植株与阴性植株的分离比为3:1的株系，正常培养，收获单株种子；选取50粒T₂代种子铺在潮霉素抗性平板上，鉴定T₃代的纯合度，收获纯合株系T₃代种子、保存，用于后续的功能分析。

(2)PCR鉴定阳性植株

利用CTAB法小量提取转基因拟南芥抗性苗基因组DNA，通过PCR检测进一步筛选阳性植株。若扩增出了目标片段，而阴性对照中没有扩增出片段，即初步证明目的基因整合到拟南芥基因组中。

(3)RT-PCR进一步鉴定阳性植株

对DNA水平检测为阳性的拟南芥植株，利用TRIzol试剂提取总RNA，反转录获得cDNA作为模板，RT-PCR检测筛选阳性转化苗。

1.2.6转基因拟南芥的耐盐功能分析

(1)转基因拟南芥种子在盐胁迫下的发芽率

转基因拟南芥种子在盐胁迫下的发芽率实验：将野生型和转基因型拟南芥种子经消毒后，分别种在0mM、100mM、150mM、200mM的NaCl的MS平板上，春化1-3d，光照培养箱培养7-15d，每天观察、统计发芽率。

(2)转基因拟南芥幼苗在盐胁迫下的存活率

幼苗的耐盐实验：将野生型和转基因型拟南芥种子经消毒后，种在MS平板上，春化1-3d，光照培养箱培养7d，选取大小生长一致的幼苗移栽至土盆，再培养2周后，用含有300mM的NaCl水溶液浇灌，每隔3-4d浇灌，7-15d后观察，取样，统计存活率，进行生理指标检测。

(3)转基因拟南芥在盐胁迫条件下的生理生化指标测定

相对含水量的测定：

对NaCl胁迫处理后的转基因和野生型拟南芥，用蒸馏水冲洗干净，吸水纸吸干表面水分。每个处理取3棵单株，并迅速测其鲜重，之后放入120℃烘箱中烘烤30min，80℃烘烤24h至恒重，称量其干重。对上述测得的干、鲜重，采用公式：相对含水量(占鲜重％)＝(鲜重-干重)/鲜重进行含水量的计算。

相对电导率分析：

称取经胁迫处理的拟南芥叶片0.2g于10mlEP管中，加入5ml去离子水，自然浸泡1h，之后测定电导率J1并记录，然后放入沸水浴中煮沸10min，冷却至室温测电导率J2并记录。

相对电导率的计算公式：相对电导率＝(J1-J0)/(J2-J0)×100％

(注：J0表示去离子水的电导率值)。

2实验结果

2.1植物表达载体的构建

2.1.1植物表达载体pH7WG2D-LcAP2/ERF107的构建流程

植物表达载体pH7WG2D-LcAP2/ERF107的构建流程见图6。

2.1.2重组质粒的PCR鉴定

在重组质粒的转化LB(Spe+)平板上，分别挑取10个白色单菌落，进行菌落PCR鉴定，结果有1个阳性克隆，提取阳性克隆的质粒，用基因LcAP2/ERF107的上、下游引物(表1)和35S上游引物(35S-F：5'-GACGCACAATCCCACTATCC-3')和目的基因的下游引物(LcAP2/ERF107-R)进行PCR鉴定，结果见图7，都扩增出了目的条带，说明植物表达载体构建正确。

2.2含有表达载体的农杆菌鉴定

将重组质粒pH7GW2D-LcAP2/ERF107转化农杆菌GV3101，以转化后的农杆菌的菌液为模板，未转化的农杆菌作阴性对照，质粒做阳性对照，进行菌液PCR鉴定。结果可见图8，10个单菌落都是阳性克隆，说明该重组质粒已成功转入农杆菌中。

2.3转基因LcAP2/ERF107拟南芥阳性苗的鉴定

2.3.1DNA水平的PCR检测

选取潮霉素抗性苗，剪取其叶片，采用CTAB法提取其DNA，以拟南芥基因组DNA为模板，以35S-F和LcAP2/ERF107-R为引物，采用PCR技术，对潮霉素抗性苗进行DNA水平的检测。结果见图9，共检测出了22株阳性苗，这表明基因LcAP2/ERF107已经整合到拟南芥基因组中。

2.3.2RNA水平的PCR检测

随机选取DNA水平鉴定的3株阳性拟南芥植株叶片为材料，提取总RNA，以反转录获得的cDNA为模板，RT-PCR对阳性苗作进一步的检测。结果见图10，3株都为阳性，这说明基因LcAP2/ERF107能够在拟南芥中进行正常转录表达从而发挥正常的调控功能。

2.4转基因拟南芥种子在盐胁迫下发芽率实验

将野生型和转基因LcAP2/ERF107拟南芥种子分别铺在含有0、100、150和200mMNaCl的MS平板上，培养10d，结果见图11，转基因LcAP2/ERF107拟南芥种子在150mMNaCl的MS培养基中，发芽率为80％，极显著地比野生型45％的发芽率高，并且在200mMNaCl的MS培养基中，结果也极显著，转基因种子萌发率为50％，而野生型的发芽率骤降至5％，说明转基因LcAP2/ERF107拟南芥种子显著提高了对高盐的抗性。

2.5转基因拟南芥幼苗在盐胁迫下存活率实验

三周龄的拟南芥幼苗，用300mMNaCl浇透，每隔一周浇一次盐水，共浇3次，周期21d，在此过程中时常注意观察表型，统计存活率。由图12看出，高盐胁迫处理21d时，野生型和转基因LcAP2/ERF107拟南芥的表型差异显著，95％的野生型拟南芥叶片干枯、植株死亡，而95％的转基因拟南芥叶片仍是绿色，植株存活率为95％。可见，在高盐持续胁迫下，转基因拟南芥具有极显著的耐盐表型，说明转录因子LcAP2/ERF107显著提高了转基因植株的耐盐性，因此，转录因子LcAP2/ERF107是百脉根AP2/ERF家族中优良的耐盐调控因子。

2.6转基因拟南芥在盐胁迫条件下的生理生化指标测定

在逆境胁迫下，植物体内会发生一系列复杂的生理生化变化，来适应或抵御外界环境造成的伤害，因此，本实验测量了盐处理、未处理的野生型和转基因LcAP2/ERF107拟南芥中的抗逆生理指标，相对含水量和电导率，由图13A看出，在正常条件下，转基因LcAP2/ERF107拟南芥和野生型的相对含水量无显著差别，在高盐胁迫下，野生型相对含水量降低至70％，而转基因的相对含水量保持在85％，极显著地比野生型的含水量高，这与表型结果也一致；由图13B看出，在正常条件下，转基因LcAP2/ERF107和野生型的电导率在20％左右，在高盐胁迫下，野生型电导率升至90％，转基因的电导率为45％，极显著地比野生型低。说明转基因LcAP2/ERF107拟南芥是通过提高相对含水量和降低细胞膜的损伤程度提高耐盐性的。