基于分子标记的8种肿腿蜂（膜翅目：肿腿蜂科）分类和花绒寄甲生物型（鞘翅目：寄甲科）研究

摘要

花绒寄甲Dastarcus helophoroides（Fairmaire）(Coleoptera: Bothrideridae)是目前我国控制天牛类蛀干害虫最主要的天敌昆虫，已经广泛应用于松褐天牛、光肩星天牛、云斑白条天牛、锈色粒肩天牛和栗山天牛等个体较大的天牛的生物防治，花绒寄甲初孵幼虫一般情况下只寄生3龄以上的天牛中老龄幼虫和蛹;而硬皮肿腿蜂Sclerodermus spp.(Hymenoptera: Bethylidae)寄生1-3龄的天牛低龄幼虫，以及吉丁类蛀干害虫，寄生率高，防治效果好。但是硬皮肿腿蜂属用于生物防治的多个种在外部形态上很相似，准确鉴定其种类较难，而且在调查我国天牛和其他蛀干害虫时还发现了几种新的硬皮肿腿蜂种类，由于本属肿腿蜂形态相似，它们是否为新种？再者，寄生不同天牛种的花绒寄甲经鉴定虽为同一种，但却表现出对其自身寄主的嗜好性，而对其他寄主趋性很弱，其是否已分化为不同的寄主生物型(Biotype)。对这些天敌的准确鉴定是生物防治成败的关键，为了解决利用这两类重要天牛天敌的分类问题，本文利用分子生物学技术，研究了硬皮肿腿蜂属目前所发现的8个种的分类地位，并研究了寄生不同天牛种的花绒寄甲，以明确其是否分化为不同的寄主生物型。论文研究结果如下:
　　1.对肿腿蜂类天敌昆虫，首次采用分子生物学技术，利用两种方法SDS法和试剂盒法对本研究室所采集、发现的8种肿腿蜂假定种的单头个体进行基因组DNA提取。通过对比琼脂糖凝胶电泳结果表明，以试剂盒法提取的单头肿腿蜂基因组DNA虽价格较贵，但提取总量大、成功提取率高、单位毫升浓度高。通过对8种肿腿蜂的COⅠ基因和28S核糖体基因部分序列结果分析松褐天牛肿腿蜂(Sclerodermus sp.(No.5))很有可能是一个新种，并向NCBI提交所有序列结果。扩增出的136条594bp的COⅠ基因片段松褐天牛肿腿蜂(Sclerodermus sp.(No.5))与其它7种肿腿蜂相比，序列相似性最大仅为85.69％，与管氏肿腿蜂、川硬皮肿腿蜂和白蜡吉丁肿腿蜂的遗传距离分别为0.165、0.165、0.161。594bp的COⅠ基因片段编码的198个氨基酸，其中管氏肿腿蜂（Sclerodermus guani）、川硬皮肿腿蜂（Sclerodermus sichuanensis）、白蜡吉丁肿腿蜂（Sclerodermus pupariae）、苹小吉丁肿腿蜂(Sclerodermus sp.(No.1))日本松脊吉丁肿腿蜂(Sclerodermus sp.(No.2))、落叶松吉丁肿腿蜂(Sclerodermus sp.(No.3))和沙蒿吉丁肿腿蜂(Sclerodermus sp.(No.4))基因翻译出的氨基酸序列完全一致，只有松褐天牛肿腿蜂有2个氨基酸差异，经过NJ树分析，松褐天牛肿腿蜂15个个体以100％的支持率单独成为与所有群体不同的单独一个分支。扩增出的536bp的28S核糖体基因序列结果显示，只有松褐天牛肿腿蜂与其它7种基因序列存在差异，其它7种肿腿蜂之间的序列相似性均为100％，而与松褐天牛肿腿蜂的序列相似性为99.18％。
　　2.测出8种肿腿蜂的核糖体间隔区ITS1-5.8S-ITS2序列全长2060bp。通过对ITS序列分析，根据ITS1序列1319-1333bp位置处“CTTCT”的个数，将管氏肿腿蜂、川硬皮肿腿蜂、白蜡吉丁肿腿蜂、沙蒿吉丁肿腿蜂、苹小吉丁肿腿蜂、松脊吉丁肿腿蜂、落叶松吉丁肿腿蜂，这7种肿腿蜂分成两类，其中，管氏肿腿蜂、川硬皮肿腿蜂、白蜡吉丁肿腿蜂、沙蒿吉丁肿腿蜂为一类，有3个“CTTCT”单元，新发现的苹小吉丁肿腿蜂、松脊吉丁肿腿蜂、落叶松吉丁肿腿蜂为另一类有两个“CTTCT”单元，所以，ITS序列能够将苹小吉丁肿腿蜂、松脊吉丁肿腿蜂和落叶松吉丁肿腿蜂从已知种管氏肿腿蜂、川硬皮肿腿蜂和白蜡吉丁肿腿蜂中区分出来，也为这些新发现的肿腿蜂个体成为新物种提供理论依据。
　　3.测出了8种肿腿蜂线粒体基因cytb，12S和16S，并提交到NCBI。分析线粒体基因的三个基因片段，并结合线粒体基因序列数据和两种方法的系统发育树(邻接法NJ和最大似然法ML)。所得的结果表明落叶松吉丁肿腿蜂的所有个体聚在一起形成一个单独的姐妹群，并且在所测的三个基因中落叶松吉丁肿腿蜂都有很高的自检支持率(90％以上)。同时cytb和12S基因也提供了有力的证明:松脊吉丁肿腿蜂的所有个体聚集为一个单独的类群（自检支持率在90％以上）。这种多个基因综合比较分析的方法，为肿腿蜂科硬皮肿腿蜂属的个体种类鉴定及线粒体基因的进化提供理论依据。
　　4.对苹小吉丁肿腿蜂、管氏肿腿蜂、川硬皮肿腿蜂、白蜡吉丁肿腿蜂、落叶松肿腿蜂和松脊吉丁肿腿蜂这些近缘种的mtDNA COⅡ-COⅢ基因区域进行了序列测定与分析。结果显示所测定的1.7kb的片段中，含有COⅡ基因部分序列，完整的tRNA-Asp基因、tRNA-Lys基因、ATPase6基因和ATPase8基因以及部分COⅢ基因。对基因序列整体分析结果表明，管氏肿腿蜂与川硬皮肿腿蜂的序列相似性最高，为100％，白蜡吉丁肿腿蜂与松脊吉丁肿腿蜂Sclerodermus sp.(No.2)的序列相似性最低为96.88％。1700bp的序列中包含68个变异位点，平均遗传距离为0.011。白蜡吉丁肿腿蜂与其它5个种（管氏肿腿蜂、川硬皮肿腿蜂、落叶松吉丁肿腿蜂、松脊吉丁肿腿蜂、苹小吉丁肿腿蜂）亲缘关系最远，形成一个单系群。另外一个大群又分为4个亚群，而Sclerodermus sp.(No.1)的所有个体与其它种亲缘关系最远，形成一个单独的亚群。本研究首次获得我国常用于生物防治的6种肿腿蜂的mtDNA COⅡ-COⅢ序列，对比分析不同基因序列分析结果可知，mtDNA ATPase6基因最适合区分6种不同肿腿蜂，可以作为肿腿蜂近缘种分类鉴定的特征基因。
　　5.利用线粒体COⅠ与ND5基因片段研究了我国花绒寄甲6种不同生物型间的遗传分化。结果表明:130条556bp的mtDNA-COⅠ基因片段中共检测到单倍型16种，多态位点21个，均为简约信息位点，分子变异分析(ANOVA)结果显示Fst值为0.24358，群体内个体间存在明显地遗传分化。最大相似法(ML)系统发育分析结果显示，聚类结果与基于不同生物型划分的6种不同生物型不符;对于130条665bp的mtDNA-ND5基因片段中共检测到17种单倍型，多态位点23个，其中简约信息位点20个，单一多态位点3个，分子变异分析(ANOVA)结果显示，Fst值为0.11861，群体内个体间存在明显地遗传分化。最大相似法(ML)系统发育分析结果显示，聚类结果与基于不同生物型划分的6种不同生物型也不相符。
　　6.通过测定多个线粒体基因序列片段(cytb，ND1，12S)研究了我国花绒寄甲6种不同生物型间的遗传分化，结果表明:130条393bp的cytb基因片段中共检测到单倍型11种，多态位点17个，简约信息位点15个，分子变异分析(ANOVA)结果显示Fst值为0.19217，群体内个体间存在明显地遗传分化。系统发育分析结果显示，聚类结果与基于不同生物型划分的6种不同生物型不符;对于130条681bp的mtDNA-ND1基因片段中共检测到17种单倍型，多态位点23个，其中简约信息位点20个，分子变异分析(AN OVA)结果显示Fst值为0.14549，群体内个体间存在明显地遗传分化。系统发育分析结果显示，聚类结果与基于不同生物型划分的6种不同生物型也不相符。而扩增出的6种不同生物型的花绒寄甲531bp的12S基因序列完全一致。本结论与上述结果5中相似。并没有将6种不同生物型区分出来，而是发现松褐天牛花绒寄甲与云斑白条天牛花绒寄甲在种群个体间不存在共享单倍型，说明在遗传上为两个独立的分支，这两个生物型群体间的基因交流受到限制，遗传距离最远。因此，根据本研究结果分析，按照不同天牛危害树种差异，最早存在2种生物型的花绒寄甲，即寄主为危害针叶树种的松褐天牛生物型和寄主为危害阔叶树种的云斑白条天牛生物型。
　　本研究利用分子生物学技术，对我国生物防治林业重大蛀干害虫的天牛和吉丁甲的主要天敌——硬皮肿腿蜂和花绒寄甲种类及生物型从基因角度进行了分类研究。利用核糖体ITS序列能将已经命名的肿腿蜂和未被命名的肿腿蜂区分开;利用COⅠ和28S核糖体基因区分出松褐天牛肿腿蜂为一新种;通过cytb，12S，16S核苷酸序列与系统进化树分析区分出松脊吉丁肿腿蜂和落叶松吉丁肿腿蜂;利用COⅡ-COⅢ区分出苹小吉丁肿腿蜂;利用COⅠ基因区分哈氏肿腿蜂(Sclerodermus harmandi(Buysson))和管氏肿腿蜂为两个不同的物种。在8个已发现的肿腿蜂基因研究中，表明管氏肿腿蜂与川硬皮肿腿蜂的序列相似性最高，为100％;白蜡吉丁肿腿蜂与松脊吉丁肿腿蜂的序列相似性最低为96.88％;白蜡吉丁肿腿蜂与其它5个种（管氏肿腿蜂、川硬皮肿腿蜂、落叶松吉丁肿腿蜂、松脊吉丁肿腿蜂、苹小吉丁肿腿蜂）亲缘关系最远，形成一个单系群。另外一个大群又分为4个亚群，而松褐天牛肿腿蜂的所有个体与其它种亲缘关系最远，形成一个单独的亚群。研究发现，mtDNA ATPase6基因最适合区分6种不同肿腿蜂，可以作为肿腿蜂近缘种分类鉴定的有效基因。利用线粒体COⅠ与ND5基因片段和线粒体基因序列片段（cytb，ND1，12S）研究了我国花绒寄甲6种不同生物型间的遗传分化，初步表明，存在寄生危害针叶树的松褐天牛花绒寄甲生物型和危害阔叶树的云斑天牛花绒寄甲生物型。本研究为区分重要的天敌昆虫种类和生物型进行了十分有价值的探索，在生物防治利用、筛选天敌中具有重要意义。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 研究背景

1．2 国内外研究现状

1．2．1 我国主要林业蛀干害虫的危害现状

1．2．2 肿腿蜂的研究进展

1．2．3 花绒寄甲的研究进展及利用DNA测序技术的遗传多样性研究

1．3 研究目标及主要研究内容

1．3．1 研究目标

1．3．2 研究的主要内容

1．4 研究技术路线

第二章 单头肿腿蜂雌虫基因组DNA提取

2．1 材料与方法

2．1．1 供试虫源

2．1．2 方法

2．1．3 基因组DNA样品检测

2．2 结果与分析

2．2．1 SDS法提取的单头肿腿蜂基因组DNA结果

2．2．2 试剂盒法提取的单头肿腿蜂基因组DNA结果

2．3 小结与讨论

第三章 基于CO1和28S基因鉴定松褐天牛肿腿蜂

3．1 材料与方法

3．1．1 供试虫源

3．1．2 实验试剂与仪器

3．1．3 DNA提取、PCR扩增、测序

3．1．4 数据处理及分析

3．2 结果与分析

3．2．1 基因组DNA检测结果

3．2．2 PCR产物检测

3．2．3 DNA序列分析

3．2．4 系统进化树构建与分析

3．3 小结与讨论

第四章 肿腿蜂的核糖体ITS序列分析

4．1 材料与方法

4．1．1 供试虫源

4．1．2 实验试剂与仪器

4．1．3 DNA提取、PCR扩增、测序

4．1．4 数据处理及分析

4．2 结果与分析

4．2．1 基因组检测结果

4．2．2 PCR产物检测

4．2．3 PCR产物胶回收结果检测

4．3．4 菌落PCR产物检测

4．2．5 酶切验证结果

4．2．6 ITS序列分析

4．2．7 遗传距离和系统进化树

4．3 小结与讨论

第五章 基于cytb，12S，16S基因分析松脊吉丁肿腿蜂和落叶松吉丁肿腿蜂

5．1 材料与方法

5．1．1 试供虫源

5．1．2 实验试剂与仪器

5．1．3 DNA提取、PCR扩增、测序

5．1．4 数据处理及分析

5．2 结果与分析

5．2．1 结果检测

5．2．2 线粒体基因序列分析

5．2．2 系统进化树分析

5．3 小结与讨论

第六章 6种肿腿蜂mtDNA COⅡ—COⅢ区域序列及分子系统进化分析

6．1 材料和方法

6．1．1 供试虫源

6．1．2 实验试剂与仪器

6．1．3 试验方法

6．1．4 数据处理

6．2 结果与分析

6．2．1 肿腿蜂mtDNA COⅡ-COⅢ基因区域的核苷酸序列

6．2．2 肿腿蜂mtDNA COⅡ和COⅢ区域序列分析

6．2．3 肿腿蜂mtDNA ATPase8基因分析

6．2．4 肿腿蜂mtDNA ATPase6基因分析

6．2．5 肿腿蜂mtDNA tRNA基因分析

6．2．6 分子系统进化树分析

6．3 结论和讨论

第七章 基于mtDNA COⅠ和ND5我国花绒寄甲6种不同生物型间的遗传分化

7．1 材料与方法

7．1．1 实验标本来源

7．1．2 试验方法

7．2 结果与分析

7．2．1 花绒寄甲DNA结果检测

7．2．2 PCR结果检测

7．2．3 序列组成

7．2．4 群体遗传结构和基因流

7．2．5 系统发育分析

7．3 小结与讨论

第八章 花绒寄甲其它线粒体基因cytb，ND1，12S基因序列变异及群体遗传结构分析

8．1 材料与方法

8．1．1 实验标本来源

8．1．2 试验方法

8．2 结果与分析

8．2．1 DNA结果检测

8．2．2 PCR结果检测

8．2．3 序列组成

8．2．4 群体遗传结构和基因流

8．2．5 遗传距离及系统发育分析

8．3 小结与讨论

第九章 结论与讨论

9．1 主要结论

9．1．1 利用核糖体ITS序列能将供试的8种肿腿蜂区分开

9．1．2 利用COⅠ基因和28S核糖体基因区分Sclerodermus sp．(No．5)

9．1．3 利用cytb，12S，16S基因区分Sclerodermus sp．(No．2)和Sclerodermus sp．(No．3)

9．1．4 利用mtDNA COⅡ-COⅢ基因区分出Sclerodermus sp．(No．1)

9．1．5 利用mtDNA COⅠ基因区分哈氏肿腿蜂和管氏肿腿蜂

9．1．6 利用多个线粒体基因序列片段研究了我国花绒寄甲6种不同生物型间的遗传分化

9．2 讨论

9．2．1 肿腿蜂分类鉴定及花绒寄甲不同生物型

9．2．2 尚需进一步解决的问题

参考文献

附录

在读期间的学术研究

致谢