短枝木麻黄种质资源遗传多样性研究

摘要

短枝木麻黄(Casuarina equisetifolia ssp.equisetifolia.L.Johnson)，为固氮型乔木，天然分布于亚热带至热带的东北部沿海地区，包括马来西亚、美拉尼西亚、菲律宾、泰国以及澳大利亚等地，常用于农林业和沿海地区防护林，同时可用作薪材以及纸浆和造纸材。短枝木麻黄是我国木麻黄科植物中引种最早且人工栽培面积最大的树种，在防风固沙、改善贫瘠土壤等方面发挥重要作用。本研究利用苗期表型性状及元素含量，幼树的生长和光合特征差异，以及EST-SSR分子标记，从表型、生理和DNA分子标记等多水平上解析来自天然种源区和引种种源区的短枝木麻黄群体的遗传多样性水平，分析短枝木麻黄群体的遗传变异规律及群体遗传结构，为短枝木麻黄种质资源的收集和保护，优良种源的选择，以及短枝木麻黄遗传改良和育种计划的制定提供理论基础。通过以上研究，总结得到以下结论:
　　(1)短枝木麻黄9月生苗的苗高和地径在区域间和区域内种源间均存在极显著差异。不同区域短枝木麻黄在2个试验点的生长趋势较为一致，大洋洲天然种源区的幼苗苗高和地径均最小，而亚洲天然种源区和亚洲引种种源区的幼苗生长较好，非洲引种种源区次之。总体上，苗高和地径在种源间的变异系数均达到25％以上，赤湖林场和岛东林场的种源重复力分别为38.41％、24.17％和20.06％、13.61％，均表现为苗高的种源重复力高于地径。参试种源中，AU1生长最差，其在岛东林场的苗高为13.18 cm，而TH2生长最好，苗高达到AU1的3.4倍。
　　(2)短枝木麻黄9月生苗表型性状分析表明，小枝粗度、一级分枝长度、二级分枝长度、小枝密度和分枝角等8个性状在区域间及区域内种源间均存在显著差异。在岛东林场，不同种源的节数、齿叶数、小枝粗度、一级分枝长度、二级分枝长度的平均值分别为25.39个、6.79枚、0.73 mm、9.37 cm、4.23 cm，变幅分别为15.06-40.78个、5.69-7.91枚、0.53-0.90 mm、4.68-14.74 cm、2.15-5.86 cm，变异系数分别为22.29％、10.61％、22.35％、31.69％、32.72％;不同种源的侧枝与主干的夹角变化较大，依据分枝角的大小，主要分为侧枝向上和侧枝平展两种类型;依据侧枝间距的大小，不同种源的小枝密度可分为密和极密等类型。节数、齿叶数、小枝粗度、一级分枝长度、二级分枝长度、小枝密度、叶色和分枝角的种源重复力分别为55.46％、34.22％、29.71％、45.32％、50.11％、48.64％、38.59％和37.75％，其中，小枝密度(24.92％)、一级分枝长度(20.63％)、二级分枝长度(19.86％)，以及分枝角(18.00％)的遗传变异系数较高。
　　(3)短枝木麻黄不同种源的9月生苗的全N含量(F=7.24**)、全P含量（F=3.47**）、全K含量(F=4.10**)、全B含量(F=4.71**)和1.5年生幼树的净光合速率(F=4.77**)、蒸腾速率(F=2.70*)均存在显著差异。全N、全P、全K、全B的种源变异系数分别为2.90％、11.16％、16.66％、31.82％。不同种源净光合速率平均值为14.13μmol CO2 m-2s-1，变幅为6.70-19.57μmol CO2 m-2s-1;蒸腾速率种源平均值为5.38 mmol H2O m-2 s-1，变幅为3.27-7.27 mmol H2O m-2 s-1。净光合速率和蒸腾速率的种源变异系数分别达到13.23％和16.08％。
　　(4)从NCBI网站获得的木麻黄EST序列34，752条，经软件预处理和去冗余后，得到12，063个非重复序列(UniGenes)，木麻黄EST序列的冗余率为65.29％。从12，063个木麻黄UniGenes中获得367个SSR位点，这些SSR位点分布于352条EST序列中。EST序列中含有SSR位点的频率仅为2.92％。二核苷酸重复基元中AG/CT数量最多，有199，占二核苷酸重复基元数的93.87％，三核苷酸重复基元中AAG/CTT最多，为56，占三核苷酸重复基元数的44.09％。
　　(5)通过筛选得到13对扩增稳定、条带清晰且具有多态性的EST-SSR标记，用于短枝木麻黄不同种源的遗传多样性分析。13个EST-SSR标记，共获得308个等位基因，平均每位点的等位基因数为23.69，等位基因数变化范围在11-48之间。13个位点的有效等位基因数量、Shannon's指数、观测杂合度以及期望杂合度的变化范围分别为在1.533-7.029，0.691-2.139，0.270-0.655和0.393-0.858。根据Shannon's指数Ⅰ的大小，5个区域遗传多样性水平的高低为:非洲引种种源区＞亚洲天然种源区＞大洋洲天然种源区＞美洲中部引种种源区＞亚洲引种种源区;29个短枝木麻黄种源遗传多样性水平的高低为:KE2＞AU1＞MY1＞TH1＞MY2＞PH1＞CU2＞SB＞MU＞CN2＞CN1＞IN2＞IN1＞PH3＞BJ＞IN4＞VU＞ LK＞VN＞AU2＞EG＞KE1＞TH4＞GU＞TO＞CU1＞PG＞BD＞PH2。Hardy-Weingerg平衡检验表明，有23个种源发生极显著的正向偏离，表现出杂合赤字或纯合过度。在区域水平上，5区域（大洋洲天然种源区、亚洲天然种源区、亚洲引种种源区、非洲引种种源区、美洲中部引种种源区）样本在11个位点皆为显著的正向偏离，表现为杂合赤字或纯合过度。说明，短枝木麻黄在整个分布范围内已经发生严重的群体内近亲繁殖，存在明显的杂合个体不足的现象。同时，Mantel检验结果表明，短枝木麻黄群体遗传分化系数FST的变化不遵循距离分离模式;多变的生存环境和遗传漂变带来的影响是造成这种分化水平的主要原因;同时，研究发现短枝木麻黄群体中近亲繁殖严重，很可能造成未来短枝木麻黄子代群体的遗传多样性的降低，这对短枝木麻黄的育种计划制定、杂交育种材料选择和种子园构建等活动有直接指导作用，应采取有效的措施来避免种群的近亲繁殖。
　　(6)短枝木麻黄种群的主要变异来源于种源内个体间，种源内个体间变异占总变异的70.12％，各区域间种源内变异大小依次为亚洲天然种源区(81.15％)＞亚洲引种种源区(74.58％)＞美洲中部引种区(72.29％)＞非洲引种种源区(68.43％)＞大洋洲天然种源区(61.45％)，表明短枝木麻黄选育种源内选择应该作为将来育种工作的重点;同时，尽管种源间变异只占总变异的25.42-38.49％，但根据上述结论中短枝木麻黄群体的近亲繁殖严重的特点，将来育种工作中更应该重视种源选择。
　　(7)根据苗期表型性状聚类分析及EST-SSR遗传多样性研究中Nei's遗传距离UPGMA聚类图，证实亚洲引种种源中，我国引种的短枝木麻黄源自亚洲天然种源区，而大洋洲天然种源区是印度、越南等国的短枝木麻黄引种种源的主要来源，肯尼亚的短枝木麻黄种源也源自大洋洲天然种源区。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．1．1 研究背景

1．1．2 研究目的意义

1．1．3 项目来源与经费支持

1．2 种质资源遗传多样性研究

1．2．1 EST-SSR技术

1．2．2 EST-SSR的识别、频率及分布

1．2．3 EST-SSR在植物研究中的应用

1．3 木麻黄遗传多样性研究

1．3．1 木麻黄种源试验研究进展

1．3．2 木麻黄营养遗传研究进展

1．3．3 木麻黄遗传多样性研究进展

1．4 主要研究内容

1．5 技术路线

第二章 短枝木麻黄种子和苗木表型性状的变异分析

2．1 材料和方法

2．1．1 试验材料

2．1．2 试验地概况

2．1．3 试验设计

2．1．4 种子千粒重及苗期性状特征调查

2．1．5 数据统计与分析

2．2 结果与分析

2．2．1 不同区域／种源种子千粒重变异分析

2．2．2 短枝木麻黄苗生长变异分析

2．2．3 短枝木麻黄苗小枝形态变异分析

2．2．4 短枝木麻黄苗枝状叶形态变异分析

2．2．5 短枝木麻黄表型性状遗传参数分析

2．2．6 短枝木麻黄表型变异程度比较分析

2．2．7 表型性状相关性分析

2．2．8 表型性状与地理因子及年降雨量相关性分析

2．2．9 两地点短枝木麻黄苗种源生长与表型差异分析

2．2．10 基于苗期表型性状的短枝木麻黄不同种源的聚类分析

2．3 讨论

2．3．1 短枝木麻黄苗期表型标记评价

2．3．2 短枝木麻黄苗期表型性状变异特征

2．3．3 短枝木麻黄不同种源苗期表型性状变异来源

2．3．4 短枝木麻黄不同种源苗期表型性状间及其与生态因子的关系及种源聚类分析

2．4 小结

第三章 短枝木麻黄苗营养元素含量的变异分析

3．1 材料和方法

3．1．1 试验地概况

3．1．2 试验材料

3．1．3 研究方法

3．2 结果与分析

3．2．1 短枝木麻黄苗不同种源元素含量差异分析

3．2．2 短枝木麻黄苗不同种源间元素含量变异比较分析

3．2．3 短枝木麻黄苗生长与元素含量及生态因子间的相关性分析

3．3 讨论

3．4 小结

第四章 短枝木麻黄幼树生长和光合参数的变异分析

4．1 材料和方法

4．1．1 试验地概况

4．1．2 试验材料

4．1．3 研究方法

4．2 结果与分析

4．2．1 短枝木麻黄幼树生长性状差异分析

4．2．2 短枝木麻黄幼树光合参数差异分析

4．2．3 短枝木麻黄幼树生长性状与光合参数变异程度比较分析

4．2．4 短枝木麻黄幼树生长性状和光合参数与生态因子的相关性分析

4．3 讨论

4．4 小结

第五章 木麻黄EST序列中SSR的分布特征

5．1 材料与方法

5．1．1 木麻黄EST序列的来源及下载

5．1．2 木麻黄EST序列的预处理

5．1．3 木麻黄EST-SSR位点的搜索

5．1．4 木麻黄EST序列的比对与注释

5．2 结果与分析

5．2．1 木麻黄EST序列的冗余性

5．2．2 木麻黄EST-SSR的分布频率

5．2．3 木麻黄EST-SSR的同源性比对及GO注释

5．3 讨论

5．4 小结

第六章 短枝木麻黄EST-SSR遗传多样性研究

6．1 材料与方法

6．1．1 试验材料

6．1．2 研究方法

6．2 结果与分析

6．2．1 SSR引物筛选和体系优化

6．2．2 SSR位点的等位基因变异

6．2．3 哈迪-温伯格平衡检验

6．2．4 短枝木麻黄群体多样性参数分析

6．2．5 短枝木麻黄的AMOVA分析

6．2．6 短枝木麻黄的遗传分化模式及基因流分析

6．2．7 短枝木麻黄群体指派分析

6．2．8 短枝木麻黄种源的聚类分析

6．3 讨论

6．3．1 微卫星(SSR)位点在短枝木麻黄群体中的变化

6．3．2 短枝木麻黄的遗传多样性

6．3．3 短枝木麻黄的遗传分化及其原因

6．3．4 短枝木麻黄种源的聚类分析

6．4 小结

第七章 主要结论与展望

7．1 主要结论

7．1．1 短枝木麻黄种源的遗传变异

7．1．2 短枝木麻黄种源的早期选择

7．2 展望

参考文献

在读期间的学术研究

附录

致谢