卡特兰花色基因克隆、表达分析及花色素成分分析

摘要

卡特兰（Cattleya Alliance）为多年生草本附生植物，原产于中南美洲，是兰科观花植物中的珍品。尽管卡特兰的栽培史在欧美已接近200年，但有关卡特兰花色形成的分子机理及花色化学的研究仍未见报道。本研究以卡特兰紫色花品种‘Pink Lady’（Cattleyahybrid‘Pink Lady’）蕾期第三期的花瓣为材料，分离克隆出两个花色素合成途径中的关键基因，并对这两个基因进行生物信息学分析。利用相对实时荧光定量的方法分析了‘PinkLady’花瓣不同发育时期的表达模式，并分析盛开期时‘Pink Lady’、‘Suzie’(Cattleyahybrid‘ Suzie’)两种品种不同花器官部位的表达模式，这为卡特兰花色分子生物学及基因工程提供了理论基础。同时，利用高效液相色谱质谱联用技术对‘Pink Lady'盛开期时各个花器官部位的花青素、黄酮及黄酮醇的成分进行结构分析，为卡特兰花色化学提供了理论依据。主要研究内容如下:
　　1.采用RT-PCR和RACE相结合的方法，首次从卡特兰花瓣中分离得到了一个查尔酮合酶(chalcone synthase，CHS)基因和一个二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol4-reductase，DFR)基因的cDNA全长，分别命名为ChCHS1和ChDFR1，GenBank登录号分别为KP171693和KP171694。序列分析发现，ChCHS1的cDNA全长1508 bp，编码394个氨基酸;ChDFR1基因的cDNA全长1250 bp，编码350个氨基酸。同源性检索和生物信息学分析表明这两个基因编码的蛋白都具有各自的功能位点和保守性特征多肽序列。氨基酸序列比对与系统进化树分析显示，ChCHS1与ChDFR1基因在兰科中与蕙兰、石斛兰关系最近，与百合科关系较近。
　　2.将卡特兰‘Pink lady’的花瓣分为五个不同发育阶段，P1（花芽1.5 cm长）、P2（花芽2.5 cm长）、P3（花芽4 cm长）、P4（花芽5 cm长，即将开放）及P5（盛开期），以这五个发育阶段的花瓣为模板用相对实时荧光定量PCR的方法分析ChCHS1与ChDFR1基因的表达模式，结果表明，ChCHS1和ChDFR1都在蕾期(P1～P3)时表达量最低，伴随花器官的发育，表达量逐渐上升，最终分别在花朵盛开期(P5)和接近开放时(P4)达到最高。
　　3.以盛开期时的‘Pink lady’、‘Suzie’不同花器官（花瓣、萼片、唇瓣、喉部）为模板，采用相对荧光定量PCR的方法对两种卡特兰品种不同花器官中的ChCHS1及ChDFR1进行表达分析。结果表明，卡特兰ChCHS1及ChDFR1基因的表达在两种品种的不同花器官部位中呈现基本相同的态势。在紫色品种‘Pink lady’的紫色花器官部位（花瓣、萼片）中ChCHS1及ChDFR1基因的表达量明显高于白色品种‘Suzie’的白色花器官部位，这一明显差异尤其表现在两个品种的花瓣中。在‘Pink lady’不同花器官中比较发现，ChCHS1及ChDFR1基因在花瓣、萼片、喉部、唇瓣的表达量逐一呈现下降趋势。而在‘Suzie’中，喉部的ChCHS1及ChDFR1基因表达量最高，其余部位的表达量无明显差异。
　　4.利用高效液相色谱(HPLC-DAD)质谱联用技术(HPLC-MSn)，推定了卡特兰‘Pink lady’花瓣中18种类黄酮物质的化学结构。分别为:异鼠李素3-接骨木二糖苷(Is3Sam)、山奈酚3-琥珀酰葡萄糖苷(Km3 SuG)、山奈酚3-没食子酰接骨木二糖苷(Km3GalSam)、山奈酚3-芸香糖-7-鼠李糖苷(Km3Ru7R)、异鼠李素3-琥珀酰芸香糖苷(Is3SuRu)、山奈酚3-葡萄糖苷(Km3G)、槲皮素3-芸香糖苷(Qu3Ru)、山奈酚3-芸香糖苷(Km3Ru)、异鼠李素3-芸香糖苷(Is3Ru)、矢车菊素3-二糖苷(Cy3Dis)、矢车菊素3-琥珀酰葡萄糖苷(Cy3SuG)、矢车菊素-没食子酰接骨木二糖苷（CyGalSam）、矢车菊素3-芸香糖-7-葡萄糖苷(Cy3Ru7G)、芍药花素3-芸香糖-7-葡萄糖苷(Pn3Ru7G)、矢车菊素3-葡萄糖苷(Cy3G)、芍药花素3-芸香糖苷(Pn3Ru)、矢车菊素3-芸香糖苷(Cy3Ru)及矮牵牛花色素3-芸香糖苷(Pt3Ru)。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．1．1 研究背景

1．1．2 国内外研究进展及评述

1．2 研究目标和主要研究内容

1．2．1 关键的科学问题与研究目标

1．2．2 主要研究内容

1．3 研究技术路线

第二章 卡特兰ChCHS1和ChDFR1基因的克隆及表达分析

2．1 材料与方法

2．1．1 试验材料

2．1．2 试验方法

2．2 结果与分析

2．2．1 卡特兰花瓣总RNA的提取

2．2．2 卡特兰CHS与DFR基因的克隆与序列分析

2．2．3 卡特兰CHS与DFR基因的表达分析

2．3 小结

第三章 卡特兰‘Pink lady’花色素成分的分析及鉴定

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料

3．1．2 试剂与标准品

3．1．3 试验仪器及设备

3．1．4 试验方法

3．2 结果与分析

3．2．1 卡特兰黄酮及黄酮醇成分的结构鉴定

3．2．2 卡特兰花青苷成分的结构鉴定

3．3 小结

第四章 结论与讨论

4．1 结论

4．2 讨论

4．3 展望

参考文献

致谢