巨桉、毛果杨、雷蒙德氏棉LBD基因家族的研究

摘要

转录因子是功能基因组时代的研究热点。植物中的家族转录因子参与调控了许多重要的生物学过程，包括形态建成、信号转导、环境应激反应等。LBD(Lateral Organ Boundaries Domain)/ASL(ASYMMETRIC LEAVES2-LIKE)蛋白是一类植物所特有的转录因子，在调控植物生长发育、营养代谢以及逆境胁迫响应等方面发挥重要作用。巨桉和毛果杨是重要的速生木本植物，其木材被广泛用于木质纤维素生物燃料的生产、造纸与纸浆工业以及纤维素原料的产品。棉花是最重要的经济作物之一，它是纤维及油料的重要来源。自2006年、2012年、2014年毛果杨、雷蒙德氏棉、巨桉全基因组测序工作分别完成以来，使得在基因组水平上对LBD基因家族进行分析成为可能。因此，本文以巨桉、毛果杨、雷蒙德氏棉为研究对象，从中鉴定出LBD基因家族并成功筛选出一批重要的LBD基因，期望为今后促进木本植物木材的形成和提高其纤维产量提供基因资源和技术支撑。主要结果如下: 利用生物信息学方法，从巨桉基因组中共鉴定出46个LBD基因，发现它们不均匀地分布在11条染色体上。基于进化关系分析，巨桉LBD基因可以分为ClassⅠ和ClassⅡ两大类，并进一步细分为Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc、Ⅰd、Ⅰe、Ⅰf、Ⅱa和Ⅱb等8个亚类。通过qRT-PCR检测LBD基因家族成员在不同组织的表达模式，发现EgLBD29基因在木质部特异地高表达，EgLBD22和EgLBD37基因在韧皮部特异地高表达。共聚焦显微镜观察结果表明，EgLBD22、EgLBD29和EgLBD37蛋白定位于细胞核。此外，本研究还发现EgLBD22、EgLBD29和EgLBD37基因的表达响应生长素和赤霉素胁迫处理。通过挑选这三个巨桉LBD基因在杂交杨树种84K(Populus alba×Populus glandulosa)中异位表达研究其功能，结果证明这三个基因对84K次生生长过程产生了不同程度的影响:过表达EgLBD37基因的84K杨的次生木质部显著增厚，过表达EgLBD29基因的84K杨的韧皮纤维显著增多，过表达EgLBD22基因的84K杨则没有明显的表型变化。通过对EgLBD22-oe、EgLBD29-oe和EgLBD37-oe转基因84K和野生型84K进行转录组测序，发现转基因84K杨中一些与赤霉素、乙烯、生长素信号通路、细胞扩增相关的重要基因的表达量明显上调或下调。这些新发现表明EgLBD29和EgLBD37基因在巨桉次生生长过程中发挥着重要的作用，本研究得到了一种促进木材形成和提高纤维产量的新方法。 从毛果杨基因组中鉴定出57个LBD基因并预测其分子量和等电点，结果表明:这些基因分布于毛果杨18条染色体以及Scaffold_65、Scaffold_86上。该家族成员基因结构简单，内含子数目不超过2个。进化关系分析显示毛果杨LBD基因可以分为ClassⅠ和ClassⅡ两大类，并进一步细分为Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc、Ⅰd、Ⅰe、Ⅱa和Ⅱb等7个亚类。分析基因表达模式发现，该家族成员的表达具有一定时空特异性，并响应氮素胁迫处理。这些工作为今后深入研究毛果杨LBD基因的功能奠定了基础。 从雷蒙德氏棉基因组中鉴定出66个LBD基因，发现它们不均匀的分布在13条染色体上。这些基因可以分为ClassⅠ和ClassⅡ两大类，细分为Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc、Ⅰd、Ⅱa和Ⅱb等6个亚类。该家族基因结构简单，外显子数目不超过3个。从雷蒙德氏棉LBD家族成员中共找出15段保守基序，并对LOB(Lateral Organ Boundaries)结构域的保守性进行了分析。基因表达模式分析揭示出雷蒙德氏棉LBD基因家族的表达具有一定时空特异性，这些结果为今后雷蒙德氏棉LBD基因功能的验证奠定了基础。

目录

声明

摘要

第一章绪论

1．1．1研究背景

1．1．2国内外研究现状及评述

1．2研究目标和主要研究内容

1．2．1关键的科学问题与研究目标

1．2．2主要研究内容

1．3研究技术路线

第二章巨桉LBD基因家族的生物信息学分析及EgLBD22、EgLBD29、EgLBD37基因的功能验证

2．1材料与方法

2．1．1材料

2．1．2方法

2．2结果与分析

2．2．1巨桉LBD基因家族成员鉴定、序列特征及系统发育分析

2．2．2巨桉LBD基因组织特异表达及对GA和IAA处理的响应

2．2．3巨桉LBD蛋白的亚细胞定位及互作蛋白预测

2．2．4植物过表达载体pI1l21-EgLBD22，pBI121-EgLBD29和pBI121-EgLBD37的构建及农杆菌介导转化

2．2．5转化植株的PCR检测

2．2．6转基因杨树荧光定量PCR检测

2．2．7转基因阳性植株的移栽

2．2．8过表达EgLBD22，EgLBD29和EgLBD37基因对次生生长的影响

2．2．9 EgLBD22-oe，EgLBD29-oe和EgLBD37-oe转基因84K植株与野生型84K植株的转录组测序分析

2．3讨论

2．4小结

第三章毛果杨LBD基因家族的全基因组分析

3．1材料与方法

3．1．1材料

3．1．2方法

3．2结果与分析

3．2．1毛果杨LBD基因家族成员鉴定

3．2．3毛果杨LBD基因家族系统进化及基因结构分析

3．2．4毛果杨LBD基因的LOB结构域保守性分析

3．2．5毛果杨LBD基因组织表达及诱导表达分析

3．3讨论

3．4小结

第四章雷蒙德氏棉LBD基因家族的鉴定及进化表达分析

4．1材料与方法

4．1．1材料

4．1．2方法

4．2结果与分析

4．2．1雷蒙德氏棉LBD基因家族成员鉴定

4．2．2雷蒙德氏棉LBD基因家族染色体定位分析

4．2．3雷蒙德氏棉LBD基因家族系统进化及基因结构分析

4．2．4雷蒙德氏棉与拟南芥LBD基因家族系统进化分析

4．2．5雷蒙德氏棉LBD蛋白基序及LOB结构域保守性分析

4．2．6雷蒙德氏棉LBD基因组织表达分析

4．3讨论

4．4小结

第五章结论和展望

5．1结论

5．2展望

参考文献

附录

在读期间的学术研究

致谢