林业剩余物土曲霉发酵制备衣康酸的研究

摘要

衣康酸被美国能源署认定为12种源自生物质的高附加值化学品平台化合物之一，广泛应用在水处理、粘合剂、合成树脂、医药等众多领域。生物发酵法是衣康酸的主要生产方法，发酵的原料以糖类和淀粉类碳水化合物为主，生产成本较高。目前农林剩余物的高效利用已成为热点，林业剩余物资源具有来源广、清洁、可持续等优点，但长久以来均被丢弃、焚烧或填埋，不仅浪费资源，也造成了环境污染，到目前为止很少有以林业剩余物资源发酵生产衣康酸的研究报道。考虑到我国粮食资源短缺的问题，以林业剩余物进行发酵产酸的研究具有迫切的现实意义。而利用林业剩余物制备衣康酸的关键问题是解决木质纤维素结构顽固难降解、菌株对木质纤维素水解液的耐受性较差等问题。为此，本研究以微生物发酵技术实现林业剩余物转化制备衣康酸为目标，利用物化联合预处理工艺，降低木质纤维素的酶解抗性、提高水解效率，同时利用复合诱变技术对衣康酸生产菌进行了诱变选育，通过过程优化技术对木质纤维素水解液发酵制备衣康酸工艺进行调控，建立了完整的高密度发酵工艺，实现了林业剩余物高效利用制备衣康酸的目标，为林业剩余物的衣康酸工业化生产提供可靠的基础数据和技术支撑。具体研究结果如下:
　　(1)菌株复合诱变耦合高通量筛选选育衣康酸高产菌株:建立了衣康酸高产菌株的48孔深孔板高通量筛选技术，并利用复合诱变技术对土曲霉CICC2433进行了诱变选育。首先通过UV-LiC1诱变获得一株突变株AtUV3-325，其衣康酸产量达到了30.02 g/L，比原始菌株的18.83 g/L提高了59.43％。随后进一步经过原生质体硫酸二乙酯诱变育种，获得一株突变株AtDES3-235，其衣康酸产量达到了50.46 g/L，较AtUV3-325提高了68.08％，较出发菌株CICC2433-3提高了167.98％。最后经过发酵过程的部分析因实验及单因素条件优化，使得衣康酸的最终产量达到了60.13 g/L。
　　(2)林业剩余物木质纤维素可发酵糖的制备:选取了慈竹下脚料以及橡子壳为原料，分别考察了不同预处理方法对酶解制糖的影响以及利用分批补料酶解工艺制备高浓度的可发酵糖。首先以化学组成变化、表面形态变化以及酶解效果为指标，考察了碱法、酸法、蒸汽爆破预处理以及三者的联合预处理方法对慈竹酶水解效果的影响。结果表明2％NaOH浸泡联合蒸汽爆破能够获得最高的木质素脱除率(51％)，并使酶水解得率从24.5％显著提高到了47.1％，借助SEM电镜、X射线衍射和红外光谱分析发现，该预处理方法对原料纤维结构的破坏力最强，大部分的纤维素维管束暴露，木质素分子结构遭到破坏，纤维素酶结合位点大大增加，从而使酶水解效率提高。梯度酶解实验结果确定了最优的加酶量为30FPU/10CBU/g预处理样品。采用分批补料酶解工艺，多次少量补料，底物浓度最终为30％，经过120 h的酶解，最终可获得107.7 g/L的葡萄糖、35.81 g/L的木糖以及7.82 g/L的阿拉伯糖，总糖总量达到了151.33 g/L。其次考察了碱法预处理中碱液浓度、处理温度以及处理时间对橡子壳酶水解效果的影响。2％氢氧化钠，121℃(0.15MPa)处理60 min可以获得最高的木质素脱除率(39.34％)，酶水解的单糖得率达到494.5mg/g处理原料，梯度酶解实验结果确定了最优的加酶量为20 FPU/20 CBU/1.5 FXU g预处理样品。通过分批补料，底物浓度最终为30％，经过120 h的酶解，最终可获得121.7g/L的葡萄糖、11.31 g/L的木糖和6.02 g/L的阿拉伯糖，总糖含量达到了139.03 g/L，为土曲霉发酵制备衣康酸提供了高浓度的廉价碳源。
　　(3) Aspergilluse terreus AtDES3-235利用水解液制备衣康酸的发酵行为研究:AtDES3-235对木糖的利用能力较葡萄糖差，木糖浓度过高会抑制衣康酸的合成，最适木糖底物浓度为60 g/L，最适葡萄糖底物浓度为100 g/L。当培养基中同时存在葡萄糖和木糖时，AtDES3-235优先利用葡萄糖生长代谢，当葡萄糖消耗至较低水平时，才开始逐步消耗木糖。菌株无法利用未经处理的水解液生长产酸，证实水解液中存在抑制因素。对发酵工艺进行调控机制研究:原料酶水解过程使用的缓冲液抑制菌株的生长产酸，以高纯水替代缓冲液进行酶水解，对还原糖的释放影响不大，而且可以排除缓冲液对土曲霉生长产酸的抑制作用;其次补加玉米浆对水解液制备衣康酸的生物转化过程意义重大，可以提高菌株对水解液的耐受程度;最后，通过调整水解液中的碳源浓度，40 g/L（以葡萄糖计）的竹材水解液可以获得19.35 g/L的衣康酸，40 g/L的橡子壳水解液可以获得13.36 g/L的衣康酸。并且，经过分批补料发酵，AtDES3-235利用竹材水解液最终可获得41.54 g/L的衣康酸，达到了纯葡萄糖培养基发酵水平的69.08％，高于现有文献报道水平。通过发酵工艺优化，在竹材/橡子壳木质纤维素水解液未经脱毒处理的情况下，菌株AtDES3-235能够利用水解液发酵产酸，并且经过分批补料发酵，衣康酸产量达到了较高水平，这为衣康酸的高产发酵提供了良好的发酵菌株，同时也为衣康酸的生物发酵过程增加了新的原料基础。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1．1 研究背景

1．1．2 国内外研究现状及评述

1．2 研究目标和主要内容

1．3 技术路线

第二章 衣康酸高产菌株的诱变选育及高通量筛选

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验试剂

2．2．2 实验仪器

2．2．3 实验材料

2．2．4 实验方法

2．3 结果与讨论

2．3．1 诱变出发菌株的优选

2．3．2 抗性筛选因素的确定

2．3．3 深孔板高通量筛选体系的建立

2．3．4 高通量筛选的应用

2．3．5 UV-LiCl诱变育种

2．3．6 突变株的稳定性考察

2．4 小结

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 实验试剂

3．2．2 实验仪器

3．2．3 实验材料

3．2．4 实验方法

3．3 结果与讨论

3．3．1 菌龄对原生质体制备的影响

3．3．2 酶解时间和酶解温度对原生质体制备的影响

3．3．3 原生质体DES诱变

3．3．4 突变株AtDES3-235的遗传稳定性

3．3．5 发酵过程参数优化

3．4 小结

第四章 不同预处理方法对竹材酶水解的影响

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 实验试剂

4．2．2 实验仪器

4．2．3 实验材料

4．2．4 实验方法

4．3 结果与讨论

4．3．1 原料预处理前后组分分析

4．3．2 酶水解得率分析

4．3．3 预处理前后原料的电镜扫描图分析(SEM)

4．3．4 X射线衍射分析

4．3．5 红外光谱(FT-IR)分析

4．3．6 加酶量对酶水解得率的影响

4．3．7 物料衡算

4．3．8 分批补料酶解糖化

4．4 小结

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 实验试剂

5．2．2 实验仪器

5．2．3 实验材料

5．2．4 实验方法

5．3 结果与讨论

5．3．1 成分分析

5．3．2 固体干重回收率

5．3．3 木质素脱除率

5．3．4 预处理对酶水解效果的影响

5．3．5 加酶量对预处理橡子壳酶水解的影响

5．3．6 物料衡算

5．3．7 分批补料酶解糖化

5．4 小结

第六章 竹材／橡子壳水解液土曲霉发酵制备衣康酸的研究

6．1 引言

6．2 材料与方法

6．2．1 实验试剂

6．2．2 实验仪器

6．2．3 实验材料

6．2．4 实验方法

6．3 结果与讨论

6．3．1 AtDES3-235发酵葡萄糖与木糖产酸的差异

6．3．2 竹材艨子壳水解液发酵制备衣康酸影响因素分析

6．3．3 水解液发酵制备衣康酸调控机制研究

6．3．4 竹材水解液分批补料发酵产衣康酸

6．4 小结

第七章 结论与展望

7．1 结论

7．2 创新点

7．3 展望

参考文献

在读期间的学术研究

致谢