极小种群野生植物长梗杜鹃的保护生物学研究

摘要

世界上大约五分之一的植物面临濒临灭绝的危险，部分种类居群个体很少、分布范围有限且忍受着由于栖息地被破坏的巨大压力，对于这些最受威胁的类群迫切需要进行保护生物学研究，长梗杜鹃（Rhododendron longipedicellatum Lei Cai&Y.P.Ma）就是其中的典型代表。
　　长梗杜鹃隶属于杜鹃属、杜鹃亚属（subg.Rhododendron）、越桔杜鹃组（sect.Vireya）、类越桔杜鹃亚组（subsect.Pseudovireya）常绿灌木，为当前国内外不可多得且极具开发利用前景的中国特有濒危植物，其美丽的树形、明亮的纯黄色花朵及不同寻常的花期赋予了这个物种极高的观赏价值;且直到2016年才作为新种被发表。自2014年以来，本研究组通过多次专门的长期野外调查，仅发现残存于云南省麻栗坡县石灰岩生境海拔约1183～1316m的5个野生居群，植株数量不足1000株。根据IUCN Red List Categories andCriteria(version3.1)属于极危状态[CR Blab(i，iii, v)]，野生资源状况令人担忧、亟待保护。本文对其野生资源概况、生物学特性、花粉形态及其特性、繁殖生物学、保护遗传学、引种驯化等方面进行了较为系统的研究，旨在为长梗杜鹃的有效保护及合理开发利用提供理论依据，并对我国其他极小种群野生植物的保护提供借鉴。主要研究结果和结论如下:
　　1.生物学特征及野生资源现状
　　长梗杜鹃为多分枝常绿灌木，高1.0～3.3 m，花叶兼美，每花序花朵数1～12不等，花梗长达3.0～5.5 cm;花色鲜黄，无任何斑点;与其他野生杜鹃花期多集中于3～6月不同，长梗杜鹃的自然花期从11月下旬持续至翌年的2月上旬，果期3～5月。通过长期野外调查及对MaxEnt生态位模型预测其适生区的实地访问，仅发现残存于云南省麻栗坡县石灰岩生境的5个野生居群，居群植株数较少，受人为干扰严重，少数植株附生于树干上;且各居群中实生苗极少、自然更新较弱，部分植株以克隆繁殖为主。
　　2.花粉形态及其特性研究
　　从花蕾膨大期到花瓣盛开期，花粉逐渐成熟，为四合体花粉，呈正四面体排列，四合体直径为43.0～65.4μm，平均51.3μm;单粒花粉近球形且表面有粘丝，具三孔沟。在扫描电镜下，花粉粒外壁为均匀的颗粒状，孔沟周围颗粒细密呈波状突起;在光镜下，花粉粒外壁为内外2层，厚度约相等为0.8～1.2μm。长梗杜鹃开花当天9:00的花粉在10g· L-1琼脂+100 g·L-1蔗糖+200 mg·L-1 H3BO3+0 mg· L-1 CaCl2的培养基中萌发率最高，达90.26％;极差分析表明，影响长梗杜鹃花粉萌发率高低的主次顺序为蔗糖→CaCl2→ H3BO3，一定浓度的蔗糖和H3BO3均起到了很好的促萌效果，而CaCl2的添加则显著抑制了其花粉萌发。此外，适宜的低温有利于长梗杜鹃花粉的贮藏，-18℃条件下贮藏48 d仍有一定的萌发力。
　　3.繁殖生物学研究
　　呈拱形弯曲的花柱不仅产生了明显的雌雄异位，避免了自花授粉;还有效减小了雨水对柱头表面分泌物固有特性的损害，提高了不良天气下长梗杜鹃的雌性适合度。长梗杜鹃整个花期一直保持较高的花粉活力，于开花当天9:00达最大(92.18％);柱头可授性于开花后第5，6天最强。鲜黄色花朵的花瓣反射光谱在360 nm和580nm有两个波峰，且主要通过对UV（short-wavelength）和green（long-wavelength）感受器的刺激来吸引熊蜂传粉和采蜜。杂交指数、花粉-胚珠比和人工授粉试验均表明长梗杜鹃自交亲和、杂交可育，繁育系统属于混合交配型，加之由熊蜂（Bombus braccatus）介导的同株异花授粉在自然条件下是主要的传粉方式（座果率高达92.7％），表明长梗杜鹃的繁育系统可能是由自交向异交演化。长梗杜鹃的传粉昆虫较为特化，仅B.braccatus才能将所携带的花粉传递至柱头上。B.braccatus不同种性由于活动规律和资源需求量的不同而导致访花频率不同，B.braccatus workers的访花频率较高，为长梗杜鹃最为有效的传粉者;而B.braccatus males的存在可能在一定程度上增强了居群内的花粉流。
　　4.转录组分析
　　采用新一代高通量测序平台Illumina HiSeq4000对其转录组测序，得到的数据过滤后进行de novo组装并聚类去冗余，获得74092个Unigenes，平均长度、N50、Q20、Q30以及GC含量分别为938 nt、1616nt、98.22％、95.20％和43.24％，其中1Kb以上的Unigenes有23879条。通过与七大功能数据库比对，分别有39876(NR:53.82％)、38065(NT:51.38％)、27384(Swissprot:36.96％)、16099(COG:21.73％)、30401(KEGG:41.03％)、17518(GO:23.64％)以及29676(Interpro:40.05％)条Unigenes获得功能注释。长梗杜鹃转录组中的Unigenes根据GO功能大致可分为生物学过程、细胞组分和分子功能3大类56亚类，其中执行生物学过程的基因最多，占41.53％;与COG数据库比对，根据其功能大致可分为25类;以KEGG数据库为参考，可归为6个代谢通路大类、32类代谢途径，并发掘出176条与人类疾病相关的Unigenes，包括内分泌及代谢疾病（167条）和抗药性（9条）。
　　5.EST-SSR特征分析及引物开发
　　通过MISA软件对转录组测序所得Unigenes进行SSR位点的发掘和分析发现含SSR的序列17354条，共得到23192个SSR，出现频率为31.30％，平均每3kb出现1个SSR。二碱基和三碱基重复为长梗杜鹃SSR主要重复单元类型，分别占SSR总数的69.25％和15.07％，187种重复基元中，所占比例最高的是(AG/CT)n(62.01％)，其次是(A/T)n(12.34％)、(AC/GT)n(4.52％)和(AAG/CTT)n(4.23％)。在SSR和CDS的交集基因中，共发现15908个SSR位点，其中2792个位于编码区，出现频率为0.076 SSR/kb，而非编码区为0.344SSR/kb，在基因编码区中出现频率最高的是三碱基重复(1356，48.57％)。在不同长度重复单元中，二碱基重复SSR长度变异程度最高，其次是单碱基重复。基于以上分析结果，从102对EST-SSR引物中筛选出17对高多态性引物，各多态位点的等位基因数从2-13，观测和期望杂合度分别从0.235-0.943以及0.271-0.800;且17个位点在同属植物羊踯躅(R.molle(Blume)G.Don)和映山红(R.simsii Planch.)中均能成功扩增。
　　6.基于EST-SSR分子标记的保护遗传学研究
　　通过17对高多态性EST-SSR标记对长梗杜鹃5个残存居群150个个体的遗传学特征进行了研究。17对标记平均数据缺失率为1％，共扩增出162个等位基因，平均每个位点的等位基因数为9.529。长梗杜鹃尽管野外资源数量有限、受人为干扰严重，但仍保持着较高的遗传多样性（He=0.559，PPB=100％）和能发挥均质化作用的基因流(Nm=2.763)，推测其可能与长梗杜鹃所处石灰岩生境、异交的繁育系统、生活型及祖先居群具有丰富的遗传基础有关。AMOVA分析表明，总遗传变异中有91.25％的变异来自居群内，居群间的变异仅占8.75％。STRUCTURE分析将5个现存居群的150个个体明显分为2个基因库，居群NJ树和PCoA分析进一步将其细分为3大类群。此外，基于SMM和TPM模型的瓶颈效应分析显示，长梗杜鹃在物种水平上均经历了遗传瓶颈。
　　7.濒危机制与保护策略
　　综合本研究结果，长梗杜鹃有性繁殖早期阶段尚未受阻，威胁各居群存活的主要因素是生态因素（包括居群隔离、生境狭窄、栖息地被严重破坏等）;加之，各居群自然更新较弱，缺乏有效的迁移途径。长梗杜鹃尽管当前仍保持着较高的遗传变异水平和基因流，但检测到正经受着遗传瓶颈的影响。因此，其保护首先应加强5个残存居群的就地保护，严禁乱砍乱伐、使其免受人为干扰;尤其是被破坏最为严重的ZWL居群，应视作一个优先保护的进化显著单元(ESU)。同时，应开展种源收集、人工繁殖及回归试验，促进近地保护和迁地保护的研究。此外，考虑到以B.braccatus为媒介的同株异花授粉在自然条件下是长梗杜鹃的主要传粉方式，并且残存居群间彼此隔离，生境片段化严重;对该物种的保护还要人为的加强居群间的花粉流，如人工辅助长距离授粉、在野外同一居群内引种其他居群的植株、在引种驯化时多居群采样等，以缓解同株异花授粉对该物种的遗传压力。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1.1.2 研究目的及意义

1.1.3 项目经费来源

1.2 国内外研究现状及评述

1.2.1 濒危植物保护生物学研究概述

1.2.2 杜鹃属植物研究概况

1.3 研究目标和主要研究内容

1.3.1 关键科学问题与研究目标

1.3.2 主要研究内容

1.4 技术路线图

第二章 长梗杜鹃的生物学特征及野生资源状况

2.1 调查方法

2.1.1 文献调查

2.1.2 实地调查

2.1.3 MaxEnt生态位模型预测适生区

2.2 长梗杜鹃形态特征

2.3 资源分布现状调查

2.4 生境描述和繁殖方式

2.5 生活史

2.6 小结与讨论

第三章 长梗杜鹃的花粉形态及其特性研究

3.1 材料与方法

3.1.1 供试材料

3.1.2 长梗杜鹃花粉形态观察

3.1.3 长梗杜鹃开花过程中花粉活力检测

3.1.4 长梗杜鹃花粉萌发试验

3.1.5 长梗杜鹃花粉贮藏力测定

3.2 结果与分析

3.2.1 长梗杜鹃花粉形态特征

3.2.2 长梗杜鹃开花过程中的花粉活力

3.2.3 蔗糖、H3BO3和CaCl2三因子对长梗杜鹃花粉萌发的影响

3.2.4 不同贮藏温度对长梗杜鹃花粉萌发力的影响

3.3 讨论

第四章 长梗杜鹃的繁殖生物学初步研究

4.1 材料与方法

4.1.1 研究物种和研究地概况

4.1.2 研究方法

4.2 数据分析

4.3 结果与分析

4.3.1 长梗杜鹃的开花物候和花部特征

4.3.2 长梗杜鹃的花粉活力和柱头可授性

4.3.3 长梗杜鹃的花瓣颜色反射

4.3.4 长梗杜鹃的杂交指数和花粉-胚珠比(P/O)

4.3.5 长梗杜鹃的套袋、去雄及人工授粉试验

4.3.6 访花昆虫的种类及访花行为

4.3.7 有效传粉者的访花频率

4.4 讨论

4.4.1 花部特征、花粉活力和柱头可授性

4.4.2 花瓣颜色反射

4.4.3 繁育系统

4.4.4 特化的传粉者

4.4.5 传粉效率

第五章 长梗杜鹃的转录组分析

5.1 材料与方法

5.1.1 试验材料

5.1.2 长梗杜鹃叶片总RNA提取

5.1.3 转录组测序

5.1.4 数据过滤和de novo组装

5.1.5 Unigene注释、CDS、TF编码能力预测以及SNP检测

5.2 结果与分析

5.2.1 长梗杜鹃转录组测序数据过滤

5.2.2 长梗杜鹃转录组de novo组装

5.2.3 长梗杜鹃转录组Unigene的NR功能注释

5.2.4 长梗杜鹃转录组Unigene的COG注释及其分类

5.2.5 长梗杜鹃转录组Unigene的GO注释及其分类

5.2.6 长梗杜鹃转录组unigene的KEGG代谢通路分析

5.2.7 长梗杜鹃转录组unigene的功能注释韦恩图及其CDS预测

5.2.8 长梗杜鹃转录组unigene的TF编码能力及SNP检测

5.3 讨论

第六章 长梗杜鹃EST-SSR特征分析及引物开发

6.1 材料与方法

6.1.1 供试材料

6.1.2 基因组DNA提取

6.1.3 SSR位点的搜索与分析

6.1.4 SSR引物设计与筛选

6.1.5 SSR引物多态性检测

6.1.6 多态性SSR引物的跨物种应用

6.2 数据分析

6.3 结果与分析

6.3.1 长梗杜鹃转录组中SSR位点的分布丰度与距离

6.3.2 长梗杜鹃转录组中SSR位点的重复单元类型

6.3.3 长梗杜鹃转录组中SSR重复基元碱基组成

6.3.4 长梗杜鹃转录组中SSR在编码区中的分布特征

6.3.5 长梗杜鹃转录组中SSR基元重复次数

6.3.6 长梗杜鹃转录组中SSR序列长度分布及变异情况

6.3.7 长梗杜鹃引物开发结果

6.3.8 遗传多样性分析

6.3.9 跨物种扩增检测

6.4 讨论

第七章 基于EST-SSR分子标记的保护遗传学研究

7.1 材料与方法

7.1.1 实验材料

7.1.2 主要溶液配制

7.1.3 实验方法

7.2 数据分析

7.2.1 群体遗传多样性分析

7.2.2 群体遗传结构分析

7.3 结果与分析

7.3.1 遗传多样性

7.3.2 遗传结构

7.3.3 聚类分析

7.3.4 遗传距离和地理距离的相关性

7.3.5 瓶颈效应分析

7.4 讨论

7.4.1 遗传多样性

7.4.2 遗传结构

第八章 主要结论、创新点及展望

8.1 主要结论

8.2 创新点

8.3 后续研究及展望

参考文献

在读期间的学术研究

致谢