枝条碳水化合物及α-酮戊二酸脱氢酶抑制剂对不定根生长的影响

摘要

无性繁殖是优良植物材料保存的重要手段，不定根的发生是无性繁殖的关键，因此，解析不定根发生调控机制显得尤为重要。扦插繁殖被认为是完整保存林木基因资源的有效手段之一。但有些树种扦插生不易生根（如银杏），并且随着年龄的增加，不定根形成更加困难。目前，对不同枝龄与扦插生根的关系已有研究报道，但不同枝龄插穗碳水化合物对不定根形成影响的研究还报道较少。此外，α-酮戊二酸被认为是碳代谢的“十字路口”:一路线是经α-酮戊二酸脱氢酶（α-KGDH）作用生成TCA中间产物琥珀酰辅酶A，另一路线是经谷氨酸合成酶生成谷氨酸，并形成γ-氨基丁酸(GABA)支路;抑制α-KGDH活性能够增强GABA支路碳代谢，但是否与不定根生成有关，也尚未见报道。针对这些问题，本论文首先以不同枝龄的银杏枝条为研究对象，研究碳水化合物含量变化与扦插不定根形成的关系;在此基础上，以模式植物杨树为材料，研究抑制α-KGDH对不定根发生的影响。这有利于了解碳水化合物及其关键代谢在林木不定根形成过程中的作用。主要研究结果如下:
　　1.以银杏不同枝龄茎段为扦插材料，分析相应位置的叶、茎段中非结构碳水化合物含量变化，并观察生根情况。结果表明:银杏扦插生根部位主要在切口处，不定根形成过程分为0-4周愈伤形成期、4-6周愈伤膨大期、6-8周不定根开始形成期、8周后不定根伸长。插穗生根率随着枝龄的增加而明显降低，下部叶片非结构性碳水化合物中多糖和总糖含量明显高于上部，但茎段非结构性碳水化合物的所有组分在上下部均无明显差异;随着枝龄的增加，相应位置叶片非结构性碳水化合物各组分含量没有明显差异，但相应茎段非结构性碳水化合物组分却明显降低，与生根率的变化趋势一致。这表明不同枝龄插穗中碳水化合物物含量与不定根的生成关系密切。
　　2.在上述分析的基础上，以模式植物杨树(84 K)组培苗为材料，利用α-KGDH特异性抑制剂琥珀酰磷酸(SP)处理幼苗茎段，研究碳代谢改变对不定根生成的影响。结果表明:阻断α-KGDH活性导致杨树不定根生长受到明显抑制，引起可溶性糖、有机酸和氨基酸代谢显著变化，伴随着GABA支路活性的增强;通过施加外源GABA也发现，其支路活性增加，并伴随着不定根生长受到抑制。这表明GABA支路与不定根发生关系密切。进一步的转录组分析发现，抑制α-KGDH活性导致根部碳代谢和激素（生长素、ABA和乙烯）代谢通路基因表达的变化，推测可能与GABA支路活性的改变有关。
　　因此，本研究结果表明非结构性碳水化合物含量与银杏不定根生长呈正相关关系(1年生＞2年生＞3年生);结合模式植物杨树中抑制α-KGDH改变碳代谢方面的研究，我们发现GABA支路活性的增加可以抑制不定根的生长，这可能是调节树木不定根发生的重要因素之一。这为今后林木无性繁殖和抗性遗传改良提供了较好的理论基础。

目录

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摘要

图目录

表目录

第一章 绪论

1．1 研究目的和意义

1．2 国内外研究现状

1．2．1 林木扦插不定根的形成与碳水化合物关系密切

1．2．2 碳氮代谢中α-酮戊二酸处于关键位置

1．2．3 抑制α-酮戊二酸脱氢酶改变碳代谢方向

1．2．4 碳氮代谢的交互作用在植物代谢中具有关键影响

1．2．5 GABA支路与碳氮代谢相关

1．2．6 碳氮代谢与GABA支路对不定根发生的影响

1．3 研究目标和内容

1．3．1 研究目标

1．3．2 研究主要内容

1．3．3 项目支持

1．4 研究技术路线

第二章 不同枝龄插穗中碳水化合物含量与不定根形成的关系

2．1 试验材料与方法

2．1．1 材料处理

2．1．2 生根观察与统计

2．1．3 可溶性糖和淀粉含量测定

2．2 结果与分析

2．2．1 生根表型观察

2．2．2 银杏树冠上、下部及其枝龄对生根的影响

2．2．3 插穗内非结构碳水化合物含量分析

2．3 讨论与小结

2．3．1 讨论

2．3．2 小结

第三章 抑制α-酮戊二酸脱氢酶活性对不定根发生的影响

3．1 试验材料与方法

3．1．1 材料处理

3．1．2 叶绿素与H202测定

3．1．3 碳氮代谢相关生理指标测定

3．1．4 三羧酸循环和GABA支路相关基因的qRT-PCR分析

3．1．5 数据分析

3．2 结果与分析

3．2．2 抑制α-酮戊二酸脱氢酶对杨树叶片叶绿素和H202含量的影响

3．2．3 抑制α-酮戊二酸脱氢酶对GABA支路相关基因表达的影响

3．2．4 抑制α-酮戊二酸脱氢酶对杨树不定根形成过程中碳氮代谢影响

3．2．5 外源施加GABA验证杨树不定根生长是否与GABA支路有关

3．3 讨论与小结

3．3．1 讨论

3．3．2 小结

第四章 抑制α-酮戊二酸脱氢酶后转录组水平的响应

4．1 试验材料与方法

4．1．1 材料处理

4．1．2 杨树组织总RNA提取

4．1．3 杨树组织转录组分析

4．1．4 杨树组织中激素含量的测定

4．2 结果与分析

4．2．1 抑制α-酮戊二酸脱氢酶对基因转录的影响

4．2．2 抑制α-酮戊二酸脱氢酶对相关激素含量的影响

4．3 讨论与小结

4．3．1 讨论

4．3．2 小结

第五章 结论

5．1 主要结论

5．2 展望

参考文献

在读期间的学术研究

致谢