线粒体异柠檬酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶系活性与创伤性脑损伤的实验研究

摘要

创伤性颅脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)越来越成为威胁人类健康的首要问题.创伤性脑损伤居儿童和成人意外死残原因之首.目前TBI伤情有不断加重的趋势,伤情亦趋复杂化.颅脑损伤后局部及全脑血流代谢不匹配已被实验及临床资料证实.线粒体作为创伤后病理反应的中心成为新近研究的焦点以及治疗的靶点.异柠檬酸脱氢酶(ISOCitrate dehydrogenaSe,ICDH)及α-酮戊二酸脱氢酶系(alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex,KGDFIC)是存在于脑组织中的线粒体酶.对于三羧酸循环的进行,能量代谢的稳定,神经递质的代谢等诸多生理及病理过程极为重要.酶活性的降低与诸多神经系统退行性疾病有关.亚低温脑保护技术已经被应用于创伤性脑损伤治疗策略之一.但是由于创伤性脑损伤病理机制的复杂性以及低温机制尚未完全阐明使得创伤性脑损伤的治疗手段繁多但缺乏规范性.本研究着眼于创伤后导致继发性损伤的关键病理反应一能量代谢异常,着重研究参与三羧酸循环的关键线粒体酶-ICDH及KGDHC在伤后的活性变化,以及动物创伤性脑损伤对酶活性调节的反应,同时研究了亚低温对创伤性脑损伤后酶活性的影响,及其与损伤病理机制的关系.期望研究代谢关键酶与创伤性脑损伤病理机制的关系能够成为创伤性脑损伤治疗的新方向. 第一部分线粒体酶(ICDH及α-KGDHC)在大鼠创伤性脑损伤后不同脑区活性变化的实验研究目的：在大鼠液压脑损伤动物模型中,研究线粒体 ICDH 及α-KGDHC 活性在损伤后不同时间点,不同脑区以及不同损伤程度中的变化.同时研究了不同损伤对大鼠神经功能的变化. 方法：成年健康SD大鼠随机分为四组:假手术组,轻度损伤组,中度损伤组,重度损伤组.每组又根据时间点不同分为伤后6h,24h,48h,72h,7d(n=5)组.应用酶-底物反应方法分别检测损伤侧以及对侧皮层,海马区以及丘脑ICDH 及KGDHC活性.应用平衡木行走实验以及Morris水迷宫对实验对象的平衡运动功能以及认知功能进行评价.实验过程中对大鼠的生理指标也同时进行了检测分析以保证模型的准确可靠. 结果：成功建立大鼠不同损伤程度的侧向液压脑损伤模型.中度及重度创伤性脑损伤后后大鼠平衡行走实验中步行逃脱时间伤后6h开始较对照组显著延长(P<0.05),一直持续至伤后7天.Morris水迷宫检测表明伤后24小时中度及重度损伤造成实验对象登台时间以及登台累计路径显著延长(P<0.05).直至伤后7天仍未恢复至对照组水平(P<0.05).ICDH及α-KGDHC活性在不同程度损伤伤后6h所有脑区均显著降低(P<0.05).而在轻度损伤对侧脑区及轻度损伤的损伤侧脑区,这种变化于伤后72小时完全恢复(P>0.05).中度及重度损伤酶活性显著降低一直持续至伤后7天. 结论：大鼠侧向液压脑损伤造成了动物伤后生理指标的显著改变.大鼠神经功能严重受损.伤后6h参与三羧酸循环的线粒体关键酶活性显著降低,全脑代谢显著全面抑制.伤后对侧脑ICDH及α-KGDHC活性在72h恢复正常.而中度及重度损伤侧酶活性直至伤后7天仍未恢复.结合伤后神经功能的障碍, ICDH以及KGDHC酶活性降低参与了大鼠的损伤后病理反应. 第二部分抑制α-KGDHC酶活性对大鼠创伤性脑损伤的影响的实验研究目的：研究抑制α-KGDHC活性对大鼠液压脑损伤的影响.探讨KGD[1C活性变化在创伤性脑损伤发生发展中的作用. 方法：实验动物随机分为3组:假手术组,溶剂对照组(中度脑损伤), KMV注射组(中度脑损伤).于损伤前24h立体定向侧脑室注射α-KGDHC抑制剂KMV.检测伤后6小时,24小时及72小时,7天损伤侧皮层及海马丘脑神经组织病理学变化,伤后24小时及72小时,7天中度液压脑损伤神经功能改变.同时检测损伤侧皮层及海马丘脑区酶活性的变化. 结果：应用5uMKMV侧脑室注射显著降低了大鼠皮层及海马丘脑区α-KGDHC活性30﹪-35﹪.中度液压脑损伤后,KMV注射组酶活性较溶剂对照组降低更为显著(P<0.05).KMV注射组较对照组皮层及海马丘脑区病理损伤(F-J神经元染色计数)加重(P<0.05).神经功能变化KMV注射组显著较对照组为差.Morris水迷宫登台时间以及累计登台路径较对照组显著延长(P<0.05).但大鼠平衡木行走逃脱时间并未显著延长(P>0.05).大鼠神经行为学评分在KMV损伤组大鼠以及对照组大鼠也未有显著差异(P>0.05). 结论：抑制脑内α-KGDHC活性显著加重了创伤性脑损伤的病理损伤程度,神经功能尤其是学习功能显著受损,但运动功能以及伤后即刻神经功能评分无显著差异. 第三部分亚低温对创伤性脑损伤后不同脑区α-KGDHC活性影响的实验研究目的：研究亚低温对α∷KGDHC活性的影响以及对创伤性脑损伤病理损伤以及神经功能的影响. 方法：实验对象随机分为三组:假手术组,中度液压损伤常温组,中度液压脑损伤亚低温组.伤后立即亚低温治疗,检测实验对象不同脑区病理组织学变化,神经功能评价以及α-KGDHC活性的变化,同时对凋亡因子-Caspalse-3的活性进行了分析检测. 结果：大鼠中度侧向液压脑损伤后早期(伤后即刻)应用亚低温(32-33℃)治疗(疗程4小时),缓慢复温(伤后1.5-2小时),显著减轻了损伤后病理变化.皮层及海马F-J染色神经元计数较对照组显著减少(P<0.05),平衡木行走实验步行逃脱时间较对照组显著缩短(P<0.01),Morris水迷宫检测大鼠登台时间以及登台累计路径较对照组显著减少(P<0.05).KGDHC活性于伤后6h,24h,72h及7d检测均较常温组显著升高(P<0.05),尽管6h及24h仍较假手术组仍较低(P<0.05),但伤后72h恢复至对照组水平,直至伤后7d(P>0.05).凋亡因子-Caspase-3活性显著降低(P<0.05). 结论：大鼠侧向液压脑损伤后早期应用亚低温治疗能够显著恢复α-KGDHC 活性,改善实验对象病理组织学损伤,提高平衡运动能力及学习能力.

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前言

第一部分：线粒体酶(ICDH，α-KGDHC)在创伤性脑损伤中活性变化的实验研究

1.实验材料及方法

2.结果

3.讨论

参考文献

第二部分：抑制α-KGDHC酶活性对大鼠创伤性脑损伤的影响的实验研究

1.实验材料与方法

2.结果

3.讨论

参考文献

第三部分：亚低温对脑损伤后线粒体α-酮戊二酸脱氢酶系活性的影响

1.实验材料与方法

2.结果

3.讨论

参考文献

总结

综述 线粒体与创伤性脑损伤

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