毛竹生殖器官发育相关miRNA挖掘与miR159-GAMYB途径对花药发育调控研究

摘要

毛竹(Phyllostachys edulis)是我国分布最为广泛、栽培历史最为悠久的笋材两用竹种，占全国竹林面积的74％以上，具有重要的经济、文化、社会价值。自然条件下，毛竹通过强大的竹鞭系统来进行地下鞭延伸为主的无性克隆繁殖，在长期的生产栽培中，该繁殖方式也被人类逐渐强化。与传统的无性繁殖方式相比，采用毛竹种子育苗进行实生苗造林具有成本低、成活率高、种苗易于管理、林分抗逆性强等优势。但毛竹自然条件下结实率低，实生苗分化严重，阻碍了有性繁殖方式的应用。尽管前人开展了一些工作，但调控结实率机制尚不明确。花药是植物最重要的生殖器官之一，对植物育性具有决定性作用，开展毛竹花药育性研究能够为提高毛竹育种奠定重要基础。
　　本文通过分析毛竹主要生殖器官的miRNA差异表达模式，筛选与毛竹育性相关的重要miRNA，对R2R3MYB基因家族的生物信息学、表达模式等进行详细分析，筛选miR159的两个重要GAMYBs靶基因。实验表明miR159及其靶基因在花药和花粉发育中起调控作用。主要研究结果如下:
　　1.毛竹生殖器官相关miRNA挖掘及其靶基因初步鉴定
　　选择毛竹叶片（营养器官）、雄蕊、雌蕊和幼胚（生殖器官）进行miRNA深度测序。共鉴定了96条已知miRNAs和152条新miRNAs，同时预测了332个靶基因，包括已知miRNAs对应靶基因243条，新miRNAs对应靶基因113条。一些高度保守的miRNA家族，例如miR156、miR159等至少参与了两个以上生殖器官的发育进程。在雄蕊中，富集程度最高的包括DNA模板转录调控和细胞特化过程相关靶基因，而参与最多的通路为植物病原菌互作通路。因此，在毛竹花药发育过程中可能经常发生以病原菌为主的胁迫响应。基于本课题组的降解组测序数据，对差异表达已知miRNA对应靶基因进行优化分析，鉴定了miR159等在内的主要miRNA对应靶标。对筛选的差异表达已知miRNA及其靶基因进行荧光定量PCR(qRT-PCR)分析，结果表明，靶基因可被其对应miRNA负调控，从而参与植物发育进程。
　　2.毛竹miR159对花药发育调控作用研究
　　选择并克隆两条包含毛竹miR159(PhemiR159)成熟序列的前体基因，将它们分别连接超表达载体异源转入拟南芥mir159ab双突变体，成功恢复了突变体的表型。因此，毛竹miR159前体基因可以在拟南芥中被正确加工为miR159成熟序列来发挥调控作用。表型分析结合qRT-PCR结果显示，AtMYB33是PhemiR159主要的拟南芥内源靶基因，对突变体表型恢复有决定性作用。Phe-PremiR159在野生型拟南芥中超表达后，会引起部分高表达的转基因株系败育。体视解剖和电子扫描结果表明，Phe-PremiR159会导致高表达转基因拟南芥花药无法正常开裂、成熟花粉无法散出而降低育性。半薄切片结果说明，Phe-PremiR15超表达株系的花药内皮层缺乏次生加厚、裂口区缺少机械外力而无法开裂。根据qRT-PCR结果，与花药开裂相关的MYB26、NST1、NST2等基因的表达量在超表达株系中均发生显著变化。因此，Phe-PremiR159可能通过负调控AtMYB33来调节这些次生增厚相关基因的表达，从而影响超表达拟南芥株系的花药开裂。
　　3.毛竹R2R3MYB基因家族和表达模式分析
　　筛选114条毛竹R2R3MYB基因进行初步分析，包括构建系统进化树、基因结构和基因进化分析等。同时根据在毛竹4个花发育阶段和雄蕊、雌蕊、颖片、稃片中的表达模式，鉴定了在毛竹花发育和生殖器官中可能存在重要调控作用的R2R3MYB基因。Gao等(2014)指出，MYB转录因子在毛竹花发育过程可能参与了赤霉素调控途径。因此，赤霉素诱导的GAST家族被选择并进行了转录组数据分析。根据表达模式构建共表达网络。结果表明，4条PheGAST枢纽基因共与44条PheR2R3MYB基因呈显著正相关(PPC＞085)，其中包括毛竹miR159的靶基因之一PheMYB2R-98。初步推测PheR2R3MYBs可以通过与PheGASTs相互协调的形式参与毛竹花器官发育过程，该结论也将赤霉素途径和毛竹有性繁殖进程有机结合起来。
　　4.毛竹GAMYB基因对花药发育的调控作用
　　毛竹包含两个受miR159靶切的GAMYB基因(PheMYB2R-42和PheMYB2R-98)，它们在雄蕊中差异表达显著，可能参与毛竹花药发育。PheMYB2R-42和PheMYB2R-98具有保守的GAMYB结构特征，并且定位在细胞核内。然而与PheMYB2R-42不同的是，PheMYB2R-98不具有转录激活活性。PheMYB2R-4和PheMYB2R-98超表达后均会导致转基因拟南芥花粉畸形、花粉活力减弱、花粉管萌发率降低等相同表型。重点对PheMYB2R-42转基因株系进行qRT-PCR分析，结果表明，PheMYB2R-42超表达后可以下调拟南芥中绒毡层PCD和孢粉素合成等关键基因的表达量，并抑制上游绒毡层早期发育相关基因的表达，从而影响转基因拟南芥花粉发育、降低雄配子的育性。由于缺少转化体系，Phemir159-GAMYB途径在毛竹花药中的调控作用无法得到验证。根据同源比对和酵母单杂交实验，初步筛选出了在毛竹中PheMYB2R-42的潜在下游靶基因PheGPAT3，推测PheMYB2R-42在miR159的负调控下，可能通过调控PheGPAT3来间接调节其他毛竹花药发育基因的表达。
　　综上所述，本文鉴定了毛竹生殖器官中已知和新的miRNAs，挖掘了与毛竹育性相关的“miRNA-靶基因”调控路径;从毛竹R2R3MYB基因家族中筛选了miR159的靶基因GAMYBs;初步验证了毛竹“miR159-GAMYB”路径在花药和花粉发育中的功能。本研究将为毛竹花药发育和有性生殖分子调控机制研究提供实验依据，为毛竹遗传育种和种质资源研究奠定一定基础。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 植物花药和花粉的发育与调控

1．2．1 植物花药和花粉发育过程

1．2．2 绒毡层的发育和调控

1．2．3 胼胝质壁的形成和调控

1．2．4 花药的开裂和调控

1．3 植物转录因子和miRNA研究进展

1．3．1 miR159家族功能研究进展

1．3．2 植物MYB转录因子功能研究进展

1．4 毛竹生殖器官发育研究进展

1．5 研究目的和意义

1．6 经费来源

1．7 研究的技术路线

第二章 毛竹生殖器官相关miRNA挖掘及其靶基因鉴定

2．1 试验材料

2．2 试验方法

2．2．1 RNA提取

2．2．2 small RNA测序和分析

2．2．3 miRNA靶基因预测和分析

2．2．4 miRNA差异表达分析和实时荧光定量PCR验证

2．3 结果与分析

2．3．1 毛竹不同组织miRNA文库测序数据整体分析

2．3．2 毛竹不同组织已知miRNAs和新miRNAs分析鉴定

2．3．3 已知miRNAs和新miRNAs在毛竹不同组织中的表达模式

2．3．4 毛竹差异表达已知miRNAs的靶基因预测

2．3．5 荧光定量PCR验证差异表达miRNAs和靶基因的表达模式

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 毛竹miR159对花药发育调控研究

3．1 试验材料

3．1．1 植物材料

3．1．2 酶和试剂

3．1．3 菌株和载体

3．2 试验方法

3．2．1 植物DNA提取

3．2．2 毛竹miR159前体基因的分析和克隆

3．2．3 载体构建

3．2．4 大肠杆菌转化

3．2．5 农杆菌转化

3．2．6 表型鉴定

3．3 实验结果

3．3．1 毛竹miR159编码基因全长克隆和序列分析

3．3．2 毛竹PremiR159可不同程度恢复mir159ab双突体表型

3．3．3 毛竹PremiR159异源转化拟南芥表型初步分析

3．3．4 毛竹PremiR159影响超表达拟南芥花药的开裂

3．3．5 毛竹PremiR159异源转化影响拟南芥花药开裂基因表达

3．4 讨论

3．4．2 毛竹miR159超表达可影响转基因拟南芥花药裂口区的开裂

3．5 小结

第四章 毛竹R2R3MYB基因家族的生物信息学和表达模式分析

4．1 试验材料

4．2 试验方法

4．2．1 在毛竹和其他物种中R2R3MYB和CAST基因的确定

4．2．2 序列分析和进化树建立

4．2．3 毛竹R2R3MYB家族Ka／Ks计算

4．2．4 基因表达量分析

4．2．5 共表达网络建立

4．3 实验结果

4．3．1 毛竹R2R3MYB和CAST家族成员的鉴定

4．3．2 毛竹R2R3MYB基因家族进化树分析

4．3．3 毛竹R2R3MYB家族序列的保守性和特征性分析

4．3．4 毛竹R2R3MYB和GAST基因表达模式分析

4．3．5 毛竹R2R3MYB和GAST共表达网络分析

4．4 讨论

4．4．1 毛竹R2R3MYB基因家族

4．4．2 毛竹R2R3MYB基因家族序列的保守性和特异性

4．4．3 毛竹R2R3MYB和GAST基因家族参与了毛竹花的发育

4．4．4 毛竹R2R3MYB和GAST基因共表达网络建立

4．5 小结

第五章 毛竹GAMYB基因对花药发育调控研究

5．1 试验材料

5．1．1 植物材料

5．1．2 酶和试剂

5．1．3 菌株和载体

5．2 试验方法

5．2．1 植物DNA提取

5．2．2 PheGAMYBs的获取和靶切位点突变

5．2．3 载体构建

5．2．4 大肠杆菌转化

5．2．5 农杆菌转化

5．2．6 表型鉴定

5．2．7 PheGAMYBs亚细胞定位分析

5．2．9 酵母单杂

5．3 实验结果

5．3．1 毛竹GAMYBs基因序列和进化分析

5．3．2 毛竹GAMYBs亚细胞定位分析

5．3．3 毛竹GAMYBs转录激活活性鉴定

5．3．4 毛竹GAMYBs异源转化拟南芥表型初步分析

5．3．5 毛竹GAMYBs影响超表达株系花粉发育

5．3．6 毛竹GAMYBs影响花粉发育相关基因的表达

5．3．7 酵母单杂体外鉴定毛竹中PheMYB2R-42下游基因

5．4 讨论

5．4．1 毛竹GAMYB基因具有保守性和特殊性

5．4．2 毛竹GAMYBs基因调控转基因拟南芥花粉发育

5．4．3 毛竹PheMYB2R-42可在体外结合PheDATP3启动子

5．5 小结

第六章 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

附录

缩略词表

在读期间的学术研究

致谢