高等植物光系统Ⅱ大量捕光色素蛋白复合体的稳定性研究

摘要

光合作用是地球上最重要的化学反应，它主要发生在叶绿体的类囊体膜上。光能是整个光合作用反应的驱动力，因此光能的捕获和传递过程将会直接影响整个生物体的光合作用表现。在高等植物中，光系统Ⅱ(PSⅡ)的大量捕光色素蛋白复合体(LHCⅡb)作为最主要的、含量最多的光能捕获和传递器官，在光合作用过程中发挥着极其重要的作用。经过数十年的研究，认为LHCⅡb主要的功能有以下四个方面：捕获和传递光能、光保护和过剩能量耗散、调节光能在两个光系统中分配和维持类囊体膜的结构。同时对其空间结构也在2.72(A)的水平上进行了解析，发现每个单体含有14个叶绿素分子(Ch1)，其中8个叶绿素a(Ch1 a)和6个叶绿素b(Ch1 b)，2个黄体素(Lut)，一个新黄质(Neo)和一个紫黄质(Vio)，3个跨膜α-螺旋和2个双亲α-螺旋。尽管目前对其空间结构和基本功能有了初步的了解，但以往研究均是对LHCⅡb的三个色素蛋白复合体(Lhcb1、Lhcb2和Lhcb3)的混合研究，而关于Lhcb1、Lhcb2和Lhcb3各自的氨基酸组成、色素组成、各种光谱性质和稳定性研究还处于起步阶段。对Lhcb1、Lhcb2和Lhcb3各自的特性研究可以使我们更加深刻地理解LHCIIb的结构和功能。
　　 本论文首先利用RT-PCR技术从豌豆(Pisum sativum L.)中提取了编码大量捕光色素蛋白复合体的三个脱辅基蛋白基因，分析了它们编码蛋白的氨基酸序列，并系统地研究了三个蛋白与其他物种中的三个蛋白之间的亲缘关系；然后在体外进行了成功的表达和与色素重组，进而对重组LHCIIb的色素组成及光谱特征进行了系统地对比和研究。实验结果表明，Lhcb1和Lhcb3的保守性高于Lhcb2，且Lhcb3最高，Lhcb1和Lhcb2的蛋白序列相似程度高于Lhcb3；Lhcb1同质三聚体的Neo含量和α-螺旋含量高于Lhcb1单体，Lhcb2单体和Lhcb3单体的α-螺旋含量高于Lhcb1单体；与Lhcb1单体和Lhcb2单体相比，Lhcb1同质三聚体和Lhcb3单体的荧光发射光谱明显红移，与核心复合物的光谱特征更加接近，这一区别可能更加有利于能量向核心传递；吸收光谱中表明，Lhcb1和Lhcb2存在两个Ch1 a吸收峰，根据分析超快吸收得到的模型(Amerongen&Grondelle，2001)，这两个吸收峰可能代表Ch1 a的两个吸收中心。
　　 在对LHCⅡb各种基本特性研究的基础之上，本论文使用三氟乙酸(TFA)、离液剂尿素、离子性去污剂SDS、非离子型去污剂Triton X-100对Lhcb1单体进行了处理，使用不同温度对Lhcb1单体和同质三聚体、Lhcb2单体和Lhcb3单体进行处理。研究了它们在不同条件下的稳定性，主要结果如下：
　　 1)低浓度的尿素不能使Lhcb1变性，但可以影响色素之间的能量传递效率和相互作用。尽管SDS可以使Lhcb1解体，但解体后的蛋白仍旧保留了部分α-螺旋结构。TFA和非离子型去污剂Triton X-100可以使Lhcb1完全解体，并且可以完全破坏蛋白α-螺旋结构，TFA主要是通过影响色素结构和增加蛋白内部的分子间排斥力来破坏Lhcb1，而Triton X-100主要是通过破坏疏水作用力来破坏Lhcb1。高温可以使LHCⅡb解体，但不能使蛋白二级结构完全消失。
　　 2)尿素、温度和Triton X-100均不引起色素本身的破坏，SDS和三氟乙酸使氢置换叶绿素卟啉环所螯合的镁离子，产生去镁叶绿素，造成色素本身结构的严重破坏。
　　 3)随着温度的升高，色素蛋白复合体的结构和功能会遭到破坏。在Lhcb1和Lhcb2中首先被破坏的是长波长吸收的Ch1a。
　　 4).就功能而言，Lhcb1同质三聚体最为稳定，其次为：Lhcb1单体＞Lhcb3单体＞Lhcb2单体；就结构而言，Lhcb1单体和Lhcb1同质三聚体相似，稍微较Lhcb2和Lhcb3稳定。
　　 5)不同处理方式均发现色素蛋白复合体的变性过程依次为：以Ch1 a为主的相互作用消失，其后依次为以Ch1 b为主的相互作用消失，以类胡萝卜素为主的相互作用，最后消失的是蛋白的二级结构。在结构受到破坏的同时，能量传递最先受到影响。
　　 6)解体过程并不是折叠过程的逆过程。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写

声明

第一章 前言

1.1 捕光色素蛋白之间的亲缘关系

1.2高等植物PSⅡ捕光色素蛋白复合体结构研究进展

1.2.1色素在LHCⅡb中的数量和结合位点

1.2.2 LHCⅡ脱辅基蛋白和色素蛋白复合体

1.2.3 LHCⅡ中的脂类分子

1.2.4三聚体和寡聚体

1.2.5LHCⅡ-PSⅡ的结构

1.3高等植物光系统Ⅱ大量捕光色素蛋白复合体功能研究

1.3.1光能的捕获和传递

1.3.2光保护

1.3.3调节光能在两个光系统中的分配

1.4高等植物捕光色素蛋白复合体折叠和去折叠研究进展

1.5本研究的目的和意义

第二章 光系统Ⅱ大量捕光色素蛋白基因的提取、表达、纯化和重组

2.1材料和方法

2.1.1豌豆幼苗的培养

2.1.2 RNA的提取和cDNA的合成

2.1.3 Lhcb1、Lhcb2和Lhcb3基因的调取和转化

2.1.4 LHCⅡb脱辅基蛋白的诱导表达和纯化

2.1.5色素的分离和纯化

2.1.6色素蛋白复合体的重组和纯化

2.1.7色素组成分析

2.1.8光谱的测定

2.2结果和分析

2.2.1 LHCⅡb DNA的扩增

2.2.2脱辅基蛋白

2.2.3超离和绿胶结果

2.2.4色素组成分析

2.2.5光谱

2.3讨论

2.3.1氨基酸序列

2.3.2 LHCⅡb的色素组成和光谱特征

2.4小结

第三章 变性剂和去污剂对Lhcb1结构和功能的影响及其诱导的变性过程

3.1材料和方法

3.1.1 Lhcb1单体的制备

3.1.2样品的处理方法

3.2结果

3.2.1荧光光谱

3.2.2 CD光谱

3.2.3吸收光谱

3.3 讨论

3.3.1 SDS对Lhcb1结构和功能的影响

3.3.2 Triton X-100对Lhcb1结构和功能的影响

3.3.3尿素对Lhcb1结构和功能的影响

3.4小结

第四章 三氟乙酸对Lhcb1结构和功能的影响及其诱导的变性过程

4.1材料和方法

4.1.1 Lhcb1的制备

4.1.2样品的处理方法

4.2结果

4.2.1荧光光谱

4.2.2 CD光谱

4.2.3吸收光谱

4.3讨论

4.4小结

第五章 温度对光系统Ⅱ大量捕光色素蛋白结构和功能的影响及其诱导的解体过程

5.1材料和方法

5.1.1 LHCⅡb的制备

5.1.2样品处理和光谱测定

5.1.3薄层层析扫描

5.1.4数据处理

5.2结果

5.2.1吸收

5.2.2荧光

5.2.3园二色光谱(CD光谱)

5.2.4薄层层析扫描

5.3讨论

5.3.1温度对不同LHCⅡb结构和功能的影响

5.3.2热稳定性差异

5.3.3 生理功能分析

5.4小结

第六章 结论

参考文献

致 谢

个人简历和博士期间发表文章情况