反义鲨烯合酶基因表达对青蒿素生物合成的影响

摘要

青蒿素是从中药青蒿中提取的新型抗疟药物，然而，青蒿素在青蒿中的含量非常低。近年来，随着青蒿素生物合成途径相关酶基因的克隆，基因工程成为提高青蒿素含量的有效途径之一。在对青蒿进行遗传转化过程中，高效稳定的丛生芽诱导体系是青蒿转化成功的关键。然而，随着继代次数的增多，青蒿丛生芽诱导能力存在退化现象。本文首先研究了滤纸对青蒿丛生芽诱导的影响和在遗传转化中的应用，进而研究了反义鲨烯合酶基因表达对青蒿素生物合成的影响。主要结果如下：
　　 研究了在丛生芽诱导培养基上加铺滤纸对青蒿丛生芽诱导的影响，结果发现，加铺滤纸后青蒿丛生芽诱导率显著提高，丛生芽诱导率能够达到97％左右。在此高效丛生芽诱导体系的基础上，我们进一步探讨了滤纸在青蒿遗传转化中的应用。结果表明，在筛选培养基上加铺一层滤纸，青蒿的抗性丛生芽诱导率能够达到59.7％，其中在12.5％的抗性丛生芽中能够得到抗性生根植株，生根植株PCR检测均为阳性，在部分PCR检测阳性的植株中检测到了GUS的稳定表达。
　　 利用上述改进的青蒿遗传转化体系，我们得到了反义鲨烯合酶基因的青蒿转化植株。PCR检测和Southern杂交检测结果证明了反义鲨烯合酶基因已经整合到青蒿基因组中。RT-PCR检测发现，在转基因株系ASQ3和ASQ5中鲨烯合酶基因在mRNA水平上得到部分抑制，鲨烯含量比对照降低了20％左右；青蒿素的含量分别提高了23.2％和21.5％，结果表明抑制鲨烯合酶表达能够有效促进青蒿中青蒿素的生物合成。

目录

文摘

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论文说明：缩略语

声明

第一章 青蒿素及相关代谢途径研究进展

1.1植物类异戊二烯代谢途径的研究进展

1.1.1异戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)的生物合成

1.1.2 HMG-CoA还原酶(HMGR)

1.1.3鲨烯合酶(SQS)

1.2.青蒿素的生物合成研究进展

1.2.1青蒿素生物合成途径

1.2.2青蒿素生物合成途径的关键酶

1.2.3青蒿基因工程研究进展

1.3本论文研究目的及意义

第二章 实验材料和方法

2.1实验材料

2.1.1菌株和质粒

2.1.2植物材料

2.1.3试剂

2.2实验方法

2.2.1质粒提取

2.2.2 DNA的酶切和连接反应

2.2.3 PCR反应

2.2.4 pfu PCR产物平末端加A尾

2.2.5 T-A克隆与蓝白筛选

2.2.6 PCR扩增片段或限制性内切酶酶切片段回收(玻璃奶法)

2.2.7大肠杆菌感受态细胞的制备及转化(CaCl2法)

2.2.8液氮冻溶法制备农杆菌感受态细胞及转化

2.2.9青蒿的遗传转化

2.2.10植物基因组DNA的提取

2.2.11转基因植物的Southern印迹杂交

2.2.12植物总RNA提取

2.2.13 RNA电泳

2.2.14 RT-PCR检测(TaKaRa RNA PCR Kit)

2.2.15 GUS染色

2.2.16转基因青蒿中鲨烯含量的测定

2.2.17青蒿素含量的测定

第三章 滤纸对青蒿丛生芽诱导及遗传转化的影响

3.1材料与方法

3.1.1植物材料和滤纸

3.1.2农杆菌菌株和载体

3.1.3培养基

3.1.4青蒿丛生芽的诱导

3.1.5青蒿的转化

3.1.6转基因青蒿的PCR检测

3.1.7转基因青蒿的GUS染色

3.2实验结果

3.2.1滤纸对青蒿丛生芽诱导率的影响

3.2.2滤纸对叶片不同部位的影响效果

3.2.3滤纸对抗性丛生芽诱导的影响

3.2.4抗性植株的生根

3.2.5 PCR检测

3.2.6 GUS染色

3.3讨论

第四章 反义鲨烯合酶基因表达对青蒿素生物合成的影响

4.1材料和方法

4.1.1植物材料

4.1.2反义鲨烯合酶基因植物表达载体的构建

4.1.3青蒿转化及转化植株的再生

4.1.4转基因青蒿的PCR检测

4.1.5转基因青蒿的Southern杂交检测

4.1.6 RT-PCR半定量检测

4.1.7鲨烯含量的检测

4.1.8转基因青蒿青蒿素含量的检测

4.2实验结果

4.2.1青蒿转基因株系的获得

4.2.2转基因青蒿的PCR鉴定

4.2.3转基因青蒿的Southern杂交鉴定

4.2.4转基因青蒿的RT-PCR检测

4.2.5转基因青蒿鲨烯含量的检测

4.2.6转基因青蒿青蒿素含量的检测

4.3讨论

参考文献

致谢

个人简历