二脂酰甘油酰基转移酶基因(DGAT1)的沉默对烟草油脂合成的影响

摘要

二脂酰甘油酰基转移酶(DGAT；EC2.3.1.20)是催化三脂酰甘油(TAG)合成的最后也是最关键步骤的酶。TAG是真核细胞中最重要的能量存储形式。在植物中，TAG主要在种子、花粉和许多物种的果实中积累。然而，DGAT1基因的转录本也存在于植物的其它器官中，这些器官包括根、茎、叶、花瓣、花粉囊、未成熟的角果、幼苗以及正在发芽的种子等。迄今为止，许多针对DGAT1基因的研究都集中于DGAT1基因的表达在对种子油脂的积累以及对种子中TAG的脂肪酸组成所起的作用上。在本研究中，我们通过构建烟草DGAT1基因带有内含子的发卡RNA(hpRNA)结构，使之在转基因烟草植株中表达双链RNA(dsRNA)，利用RNAi原理达到使烟草内源DGAT1基因沉默的目的。转基因沉默烟草植株的获得将会为更好地研究DGAT1基因的功能奠定基础。本实验不仅研究分析了DGAT1基因的抑制对烟草种子油脂积累的影响，还对表现出沉默性状的转基因植株Sil7的不同器官中TAG的含量以及DGAT1的转录水平等进行了研究分析。此外，通过对转基因烟草不同株系种子中的主要贮藏物质——油脂、蛋白质和糖的含量测定，初步揭示出在烟草种子中三者生物合成代谢之间存在的相关性。主要研究结果如下：
　　 采用烟草DGAT1基因的第615～1293碱基之间679bp的片段构建了能表达发卡RNA(hpRNA)结构的表达载体，并转化烟草(Nicotiana tabacum)Wisconsin38。Northern杂交分析发现，与野生型对照烟草(WT)相比，在沉默植株的花和发育状态种子中DGAT1基因的转录水平有很大降低，这表明该发卡结构能够高效率地引起烟草DGAT1基因的沉默。此外，在对Sil1至Sil12共12株转基因烟草进行油脂含量分析的结果表明，其中有8株表现出油脂降低的性状，转基因沉默效率达到67％。这表明：利用RNAi的方法可对目标基因进行特异降解来研究基因的功能，因此是一个在研究基因的表达功能上十分有效的方法，而且已成为植物基因工程的有力工具。
　　 为了研究DGAT1基因的沉默对转基因植株不同器官的影响，本实验分析了转基因植株Sil7的不同器官中TAG的含量和脂肪酸组成，并采用RT-PCR方法对野生型对照和转基因植株中DGAT1基因的转录水平进行了比较分析。研究发现，转基因植株不同器官中DGAT1基因转录水平的降低与各器官中TAG含量的减少呈正相关。由此看来，植物中DGAT1的表达水平与植物的各个器官内TAG的含量之间存在着一定的对应关系。此外，在转基因植株Sil7不同器官中依然能够产生TAG，这说明或者DGAT1酶活性丧失而由其它的酶(如DGAT2和PDAT)参与TAG的合成，或者DGAT1酶活性只是部分地受到影响。本实验还对Sil7的根、茎、叶、花瓣和种子中TAG的脂肪酸组成进行了分析，结果发现，与烟草野生型对照相比，在Sil7的这些器官中，除种子中TAG的脂肪酸组成无明显变化外，其余器官中TAG的18∶3/18∶2脂肪酸比例均有明显升高。
　　 对其中8株转基因烟草种子进行油脂含量分析发现，在转基因烟草中由于DGAT1基因的沉默引起种子中TAG含量的减少，从而引起了种子平均千粒重的下降。而在TAG含量和种子平均千粒重下降的同时，种子中其它贮藏物质-蛋白质和糖类的含量却增加了。该实验结果表明：在烟草种子中TAG的生物合成与蛋白质和糖类物质的合成之间存在着负的相关性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写词表

第一章 综述

1.三脂酰甘油(TAG)的生物合成

1.1脂肪酸的合成

1.2 TAG的生物合成

1.3 TAG的去饱和过程

1.4油体的形成

2.二脂酰甘油酰基转移酶(DGAT)的研究现状

2.1编码DGAT类似蛋白的基因家族

2.2有关DGAT1基因功能的研究

2.3 DGAT1基因在拟南芥中的研究

3.RNAi(RNA interference)研究概况

3.1 RNAi的分子机制

3.2 RNAi的生物学功能

3.3 RNAi技术在植物功能基因组研究中的应用

4.本研究的目的和意义

第二章 材料与方法

1.实验材料

1.1菌株

1.2质粒

1.3植物材料

1.4引物

1.5使用的药品和常用试剂

2.实验方法

2.1植物总DNA的微量提取(SDS法)

2.2植物总DNA的大量提取(CTAB法，改自Porebski，1997)

2.3质粒DNA的微量提取(碱裂解法)

2.4大肠杆菌感受态细胞的制备

2.5大肠杆菌的转化

2.6普通PCR扩增

2.7植物总RNA的提取(Trizol试剂法)

2.8 RNA的变性凝胶电泳

2.9 Northern杂交

2.10 DNase I(RNase free)消化Total RNA

2.11 cDNA第一条链的反转录合成

2.12 RT-PCR法检测转基因植株基因转录水平

2.13用玻璃奶方法回收DNA片段(道普公司试剂盒)

2.14用离心柱法回收DNA片段(鼎国公司试剂盒)

2.15 PCR产物末端加A反应

2.16酶切与连接反应

2.17农杆菌感受态细胞制备及其转化

2.18农杆菌双元载体中mini-Ti质粒提取

2.19烟草的遗传转化

2.20烟草总脂的提取、分离及脂肪酸组成分析

2.21种子内蛋白和糖类的提取及含量测定

第三章 烟草DGAT1基因沉默表达载体构建与转基因植株的筛选

1材料和方法

1.1实验材料

1.2烟草NtDGAT1基因cDNA中间片段的扩增

1.3 RNAi沉默表达载体的构建

1.4烟草的转化与培养

1.5烟草转化株的PCR筛选

2.结果与分析

2.1 NtDGAT1基因cDNA中间片段的克隆

2.2沉默表达载体pAT-DHP的构建

2.3转基因烟草植株的初步鉴定

3.讨论

第四章 DGAT1基因的沉默对转基因烟草植株不同器官油脂水平的影响

1材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2实验结果

2.1转基因植株Si17的花与种子中DGAT1基因的表达研究

2.2转基因植株Si17不同器官的沉默效果

2.3不同器官中DGAT1基因的转录水平

3.讨论

第五章 烟草中DGAT1基因的沉默对种子内油脂、蛋白质和糖类代谢的影响

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.实验结果

2.1利用RT-PCR方法检测转基因植株中DGAT1基因的转录水平

2.2 DGAT1基因的沉默引起转基因植株种子内TAG含量的降低

2.3转基因植株的种子重量下降

2.4转基因植株种子中油脂、蛋白和糖之间的合成代谢关系变化

3.讨论

结 论

参考文献

博士期间论文发表情况

致 谢