PI3K/Akt信号通路下游关键分子对甲型流感病毒增殖的影响

摘要

病毒在感染宿主细胞后可以激活细胞内的信号转导来支持自身的高效复制。甲型流感病毒感染可以激活宿主细胞的PI3K/Akt通路。但是PI3K/Akt通路在流感病毒感染过程中支持流感病毒有效复制下游具体机制并不清楚。为了进一步揭示PI3K通路对流感病毒增殖进行调控的具体分子机制，本研究立足于PI3K通路下游两个主要的生物学效应(细胞凋亡和翻译起始的调节)，探讨了PI3K/Akt信号通路的三个关键的下游分子mdm2、GSK-3β和mTOR对流感病毒感染过程的影响。在研究mdm2、GSK-3β和mTOR对流感病毒诱导的细胞凋亡的调控作用中，本研究主要通过RNA干扰技术使mdm2、GSK-3β或mTOR基因表达下调后，应用Caspase Glo3/7凋亡检测试剂盒和流式细胞术检测了流感感染细胞凋亡水平的变化，应用CCK-8试剂盒检测了细胞活力的改变，并检测了对细胞上清的流感病毒滴度的影响。
　　在mTOR介导的翻译调控对流感病毒感染过程影响的研究中，本研究采用蛋白免疫印记方法检测了mTOR下游两个关键翻译调控分子4E-BP1和p70S6K在流感感染细胞，PI3K抑制剂LY294002或mTOR抑制剂rapamycin处理的流感病毒感染细胞磷酸化水平的变化。通过NP蛋白间接免疫荧光实验及细胞液中的病毒滴度等实验检测了相应的病毒增殖水平。本研究还使用真核表达载体在细胞内表达甲型流感病毒的NS1蛋白，并检测了NS1蛋白表达对Akt及4E-BP1磷酸化的影响。在对流感病毒诱导的细胞凋亡的研究中，本研究发现：mdm2分子在流感病毒感染过程中发生了有趣的亚细胞定位变化；mdm2基因表达下调增强了流感病毒感染的A549细胞的细胞活力并降低了流感病毒感染造成的A549细胞凋亡，同时提高了细胞上清中的病毒滴度；GSK-3β基因表达下调降低了流感病毒感染的A549细胞的细胞活力并且增强了流感病毒感染造成的细胞凋亡，同时降低了细胞上清中的病毒滴度；mTOR基因表达下调降低了流感病毒感染的A549细胞的细胞活力并且增强了流感病毒感染造成的细胞凋亡，同时降低了细胞上清中的病毒滴度。在对于流感病毒蛋白翻译控制的研究中，本研究发现：甲型流感病毒感染激活了PI3K/Akt通路并可以引起4E-BP1的磷酸化；使用LY294002阻断PI3K/Akt信号通路可以同时阻断p70S6Kianse和4E-BP1的磷酸化；使用Rapamycin阻断mToRC1的功能可以阻断p70S6K的磷酸化而对4E-BP1的磷酸化并没有显著影响，特别是在感染后期；LY294002影响了流感病毒NP蛋白的表达和出核并降低了流感病毒的滴度，而Rapamycin对流感病毒NP蛋白的表达和出核过程没有明显影响但是却降低了流感病毒的滴度；使用质粒表达流感病毒的NS1蛋白可以激活PI3K/Akt通路并磷酸化4E-BP1。以上研究结果提示甲型流感病毒的NS1蛋白可以通过PI3K/Akt信号通路磷酸化4E-BP1并可能因此影响了病毒蛋白的翻译。
　　本研究揭示了mdm2、GSK-3p和mTOR对甲型流感病毒诱导的细胞凋亡的调控作用以及对病毒增殖的影响。同时研究了mTOR介导的翻译调控在流感病毒感染中的作用。本研究扩充了我们对流感病毒感染过程的认识，为流感的防治奠定了基础。