兽疫链球菌合成透明质酸相关基因的克隆与表达

摘要

透明质酸是一种由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖以β-1-3和β-1-4糖昔键相连的二糖单位重复构建而成的，具有生物相容性的高分子聚合物。由于特殊的生理作用、独特的流变学特性和极强的持水保湿能力，透明质酸在医学研究、临床治疗、化妆品工业等领域有广泛的应用。 透明质酸广泛分布于各种动物组织中，一些兼性厌氧革兰氏阳性链球菌，如链球菌属A群(group A streptococcus,GAS)，C群(group C streptococcus,GCS)的菌膜中也有透明质酸存在。由于动物组织的原料有限，且透明质酸的含量低，同时提取成本高，因而价格十分昂贵。而微生物发酵法，所需的原料易得，大大降低了生产成本。 本研究首先对兽疫链球菌(Streptococcus Zooepidemicus)中与透明质酸合成有关的基因做了研究，主要包括透明质酸合成酶基因和磷脂酰甘油磷酸合成酶基因以及透明质酸分解酶基因。 透明质酸合成酶基因是生物合成HA途径中的关键酶，其活性和稳定性决定了透明质酸产量和质量，它还参与HA输出到胞外。对实验室保存的兽疫链球菌的透明质酸合成酶基因的进行了克隆及测序，通过序列分析，证明其属于合成透明质酸活性较高的合成酶，同时也结果验证了实验室保存生产透明质酸的链球菌为兽疫链球菌。 分离得到兽疫链球菌的磷脂酰甘油磷酸合成酶基因序列。序列分析显示：其开放阅读框为531的碱基，序列编码的蛋白含有176个氨基酸残基，分子量为19400，等电点为8.8，其中含有63个疏水氨基酸，预示其可能膜结合特性。二级结构预测发现该蛋白含3个跨膜域。此外，该蛋白与已知的产脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的磷脂酰甘油磷酸合成酶具有85％的氨基酸序列相似性。磷脂酰甘油磷酸合成酶基因，它与心磷脂的合成有密切关系，心磷脂是对透明质酸合成酶的生物活性及稳定性有重要影响。它的分离对提高透明质酸合成酶活性，对提高透明质酸产量及提高分子量提供理论基础。对本实验室保存的兽疫链球菌改造提供了一个方向。透明质酸分解酶是是一种胞外酶，能够裂解透明质酸，会降低发酵生产透明质酸的产量。课题研究了实验室保存的兽疫链球菌是否含有透明质酸分解酶基因，从序列分析结果来看，实验室保存的兽疫链球菌不同于其他已经诱变工业菌种，它是含有透明质酸分解酶基因的。

目录

文摘

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声明

第一章文献综述

1.1透明质酸介绍

1.1.1 HA的命名

1.1.2 HA的理化性质

1.1.3 HA的结构

1.1.4 HA的应用

1.2透明质酸制备的历史和现状

1.2.1 HA的合成

1.2.2 HA的生物合成

1.2.3 HA的两大类制备方法比较

1.2.4发酵法生产HA的现状和所遇到的问题

1.2.5体外合成HA的构想和遇到的问题

1.3本课题研究的思路

第二章材料和方法

2.1透明质酸合成酶基因(hasA)片段的克隆与表达

2.1.1 PCR引物的设计

2.1.2提取兽疫链球菌总DNA

2.1.3 PCR扩增S.equi的hasA片段

2.1.4测序鉴定HAS基因(hasA)

2.1.5 HasA片段的表达质粒的构建

2.1.6 HasA片段的表达

2.2兽疫链球菌磷脂酰甘油磷酸合成酶基因(Pgsa)的克隆与表达

2.2.1与磷脂酰甘油磷酸合成酶基因相关片段的克隆

2.2.2与磷脂酰甘油磷酸合成酶相关片段pgsa_sz的表达载体的构建

2.2.3磷脂酰甘油磷酸合成酶相关段的诱导表达

2.2.3序列分析pgsa基因

2.3透明质酸分解酶基因（hylA)片段的克隆与表达

第三章结果和分析

3.1S.equi总DNA的提取

3.2透明质酸合成酶基因hasA片段的克隆与表达

3.2.1 HasA片段的PCR扩增结果：

3.2.2 HasA表达载体的构建

3.2.3 HasA的测序结果：

3.2.4 HasA基因在E.coli中的表达及活性的测定

3.3磷脂酰甘油磷酸合成酶基因(pgsa)片段的克隆与表达

3.3.1 pgsa片段的PCR扩增：

3.3.2 pgsa测序结果

3.3.3 pgsa序列分析

3.3.4 pgsa表达载体的构建

3.3.5pgsa在大肠杆菌BL21中的表达:

3.4透明质酸分解酶基因hylA片段的克隆

第四章讨论

4.1透明质酸合成酶(HAS)与HA合成

4.1.1 它们具有的共同的特点：

4.1.2链球菌队合成酶的特点：

4.1.3 HA链延伸机制

4.2兽疫链球菌磷脂酰甘油磷酸合成酶基因（pgsa）的克隆与表达

4.2.1 pgsa基因的作用

4.2.2 pgsa基因编码的蛋白在HA合成中的作用

4.2.3 pgsa基因克隆的意义

4.3兽疫链球菌分解酶基因(hylA)的克隆

4.4问题与展望

第五章结论

参考文献

附录

致谢

研究成果及已发表的学术论文

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