兽疫链球菌透明质酸代谢途径中基因功能研究

摘要

兽疫链球菌是工业上生产透明质酸(Hyaluronic acid，HA)的主要菌株，但是兽疫链球菌中HA合成途径中基因的功能还没有得到系统的研究。目前，几株兽疫链球菌全基因组序列的公布及HA生物合成途径的阐述，为HA合成途径中基因的功能研究提供了理论基础。本论文以兽疫链球菌ATCC39920为研究对象，主要研究结果如下:
　　(1)通过BLAST发现兽疫链球菌HA合成途径中所有基因均存在且通过RT-PCR分析发现11个基因都得到表达。分析发现，均有两个不同的基因编码UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、葡萄糖-6-磷酸变位酶和双功能酶（乙酰基转移酶和焦磷酸化酶），编码其他酶的基因只有一个;在has操纵子上有5个连续排列的基因，包括hasA、hasB、hasC1、hasD、hasE，其余基因均在远离has操纵子的位置。
　　(2)对编码葡萄糖-6-磷酸变位酶的两个基因pgm、pgmA功能的研究。通过表型和发酵分析发现，与野生型相比，Δpgm长势相对较快，ΔpgmΔpgmA长势相对较弱，且ΔpgmA和ΔpgmΔpgmA菌落与野生型相比菌落较小，没有粘性荚膜，发酵分析中也检测不到HA;进一步对Pgm及PgmA进行体外表达、纯化及酶活检测，发现PgmA对底物葡萄糖-1-磷酸的特异性更强;体内酶活分析发现，Δpgm、ΔpgmA和ΔpgmΔpgmA的PGM酶活分别比野生型菌株降低了38.1％、69.6％、84.2％。以上结果表明，Pgm和PgmA在兽疫链球菌体内均发挥葡萄糖-6-磷酸变位酶作用，且pgmA对HA的生物合成起着更重要的作用。
　　(3)对编码葡萄糖胺-6-磷酸合成酶基因glmS功能的研究。利用基因插入失活的方法筛选得到ΔglmS，且ΔglmS在不添加葡萄糖胺(GlcN)的THY培养基中不能生长;进一步研究GlcN的浓度对ΔglmS生长的影响时发现，当GlcN添加浓度为1 mg/mL时，ΔglmS的长势与野生型菌株差不多。以上结果表明，glmS是兽疫链球菌中编码葡萄糖胺-6-磷酸合成酶的基因，而且可以作为一种筛选标记基因。
　　(4)通过表型和发酵分析发现，与HA合成相关基因的缺失，对兽疫链球菌ATCC39920的生长及HA的生物合成有不同的影响;与细胞壁合成相关的Glc-1-P、UDP-Glc和UDP-GlcNAc合成受阻时，不仅HA合成受阻，菌体细胞壁也不能正常合成，随之会导致菌体不能正常生长。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 透明质酸

1．1．1 透明质酸的发现

1．1，2 透明质酸的特征

1．1．3 透明质酸的分布

1．1．4 透明质酸生物学功能

1．1．5 透明质酸的应用与市场

1．2 微生物法生产透明质酸

1．2．1 透明质酸生产方法

1．2．2 微生物法产透明质酸

1．3 兽疫链球菌透明质酸合成途径中基因研究现状

1．3．1 兽疫链球菌中一种有效的基因敲除系统的构建

1．3．2 兽疫链球菌中HA合成途径相关基因研究现状

1．3．3 葡萄糖-6-磷酸变位酶(PGM)研究进展

1．3．4 葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(GlmS)的研究进展

1．4 本课题的研究思路

1．4．1 研究背景及意义

1．4．2 研究内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 所用菌株和质粒

2．1．2 工具酶和相关试剂

2．1．3 主要仪器和设备

2．1．4 培养基和主要溶液的配置

2．2 实验方法

2．2．1 兽疫链球菌基因组DNA的提取

2．2．2 琼脂糖凝胶电泳

2．2．3 大肠杆菌感受态细胞的制备

2．2．4 pgm敲除载体pLHl167(pSET4s∷sacB∷pgmLR)的构建

2．2．5 pgmA敲除载体pLH170(pSET4s∷sacB∷pgmALR)的构建

2．2．6 glmS敲除载体pLH127(pSET4s∷sacB∷glmS∷cat)的构建

2．2．7 pgm表达载体pLH168(pET28a(+)∷pgm)的构建

2．2．8 pgmA表达载体pLH169(pET28a(+)∷pgmA)的构建

2．2．9 兽疫链球菌感受态的制备及电转化

2．2．10 敲除菌株的筛选及鉴定

2．2．11 兽疫链球菌RNA的提取及RT-PCR

2．2．12 Pgm、PgmA蛋白的诱导表达、纯化及酶活测定

2．2．13 兽疫链球菌代谢产物的分析测定

3 结果与讨论

3．1 与HA合成相关的基因的生物学信息及在染色体上的位置

3．2 与HA合成相关的基因在转录水平的分析

3．2．1 兽疫链球菌ATCC39920总RNA的提取

3．2．2 与HA合成相关的基因在转录水平的分析

3．3 兽疫链球菌ATCC39920基因组的提取

3．4 编码葡萄糖-6-磷酸变位酶(PGM)基因功能的研究

3．4．1 Pgm与PgmA功能域的预测

3．4．2 Pgm与PgmA氨基酸序列的比对

3．4．3 pgm与pgmA基因的敲除

3．4．4 pgm与pgmA单、双基因敲除菌株与野生型菌株表型分析

3．4．5 pgm与pgmA单、双基因敲除菌株与野生型菌株摇瓶发酵分析

3．4．6 Pgm与PgmA在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达、纯化及酶活分析

3．6 编码葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(GlmS)基因功能的研究

3．6．1 glmS功能域的预测

3．6．2 glmS敲除载体pLH127的构建

3．6．3 glmS敲除菌株的筛选与鉴定

3．6．4 glmS敲除菌株与野生型菌株表型分析

3．7 与HA合成相关基因敲除菌株的表型分析及摇瓶发酵分析

3．7．1 与HA合成相关基因敲除菌株的表型分析

3．7．2 与HA合成合成相关基因敲除菌株的摇瓶发酵分析

4 结论

5 展望

参考文献

7 攻读硕士学位期间发表论文情况

致谢