微流控芯片平台上细胞捕获及药物作用分析方法研究

摘要

细胞是生物体最基本的结构单元和功能单元,细胞的研究是生命科学研究的基础,对人类的发展具有重大的意义。对细胞的形态、繁殖与分化、衰老与凋亡、迁移、细胞间的信息传递、细胞的分泌排泄等生命活动的研究有助于探索生命活动的规律与本质、疾病的诊断与治疗。但是常规的细胞研究方法存在以下几个难点:(1)细胞的尺寸微小,难于操纵；(2)细胞内成份复杂且含量微小,并包含有大量的生物学信息,需要高通量的分析和高灵敏度的检测手段；(3)传统的细胞培养方法无法提供复杂、微尺度的生长环境。而微流控芯片技术的出现,从很大程度上克服了这些难点。微流控芯片由于自身微尺寸的特点,具有试剂消耗量小、分析速度快、便于集成化,微型化和自动化程度高等优势,已被广泛应用于分析化学、生命科学等领域。近年来,微流控芯片技术在细胞分析中的研究受到了越来越广泛的关注。
　　 本论文针对生命科学领域中对细胞分析的迫切要求,同时为了解决常规细胞分析方法中遇到的一些问题,在微流控芯片上开展了以细胞为基础的疾病诊断和药物开发的相关研究。具体开展了以下四个方面的工作:
　　 1、微流控芯片上基于免疫磁珠法分选CD4+T淋巴细胞用于艾滋病的诊断。在微流控芯片上通过灵活设计含有扩大反应室的Y型微通道,并结合一步免疫磁珠法捕获和分离CD4+T淋巴细胞,并对其计数。实验中以小鼠胸腺中提取的细胞悬液作为样品,首先在外加磁场的作用下将包被有CD4抗体的免疫磁珠固定在微通道的反应室中,然后利用免疫磁珠表面的CD4抗体与细胞表面的CD4抗原之间的特异性免疫反应将CD4+T淋巴细胞捕获并分离。CD4+T淋巴细胞的计数只需一个普通的显微镜即可完成。此外,实验中使用的Y型微流控芯片,将截面积放大的反应室的两个末端设计成对称的圆锥形,是为了减小液体的死体积,有助于细胞的捕获。实验中为了获得最大的细胞捕获效率,对反应室的截面积和细胞悬液的进样流速进行了优化,实验过程中无需复杂的样品预处理,并且整个分析时间只需约15分钟。研究结果表明,建立的CD4+T淋巴细胞计数平台能应用于艾滋病的诊断,并能极大地降低医疗费用,适合于资源匮乏的地区推广使用。
　　 2、微流控芯片上基于水凝胶包裹的细胞用于抗癌药物分析。将微流控芯片与紫外可控光聚合联用,利用荧光倒置显微镜在微通道中加工出位置和形状可控的三维水凝胶微结构。利用该技术将人肝癌HepG2细胞和人肺癌A549细胞同时固定在微通道的同一个水凝胶微阵列中,并用不同的水凝胶微结构形状加以区别。在同一微通道中还可以加工出含有多种活细胞的水凝胶微阵列,有助于进行高通量的细胞分析。实验中我们研究了光刻法加工水凝胶微结构的过程中,预聚物的组成和紫外照射时间对光交联的水凝胶内包裹细胞的活性影响。通过优化条件,细胞的活性几乎能达到100％。对水凝胶包裹的细胞进行长时间的培养发现绝大部分细胞能保持至少三天的活性,因而能用于以细胞为基础的检测。此外,用两种抗癌药对水凝胶包裹的HepG2和A549细胞进行刺激并诱导其凋亡,研究了细胞内与凋亡有关的谷胱甘肽和活性氧自由基两个氧化还原参数的变化。研究结果显示,这两种抗癌药对两种细胞内谷胱甘肽和活性氧自由基的影响程度不同,而放线菌素D对HepG2细胞的作用效果最为明显,证明了药物诱导细胞凋亡具有选择性。该平台提供了一个简单、快速、且高通量的分析方法用于监测抗癌药物对肿瘤细胞的影响,在基础生物医学研究中具有远大的应用价值。
　　 3、开发了一种微流控芯片与质谱联用的新技术用于药物代谢的研究。该微流控芯片上包含两个不同功能的单元结构:(1)用于细胞培养的圆形小室；(2)质谱检测前用于样品除盐和富集的固相萃取微柱。将两个不同的功能单元通过聚乙烯管相连,从而将药物代谢相关的操作单元如细胞培养、药物刺激、代谢物的产生、样品的预处理和检测同时集成到一个微流控设备上。为了评价该平台进行药物代谢研究的可行性,以维生素E在A549细胞内的代谢为模型进行了验证。实验中用ESI-Q-TOF质谱成功的检测到了两种代谢产物,且整个检测时间只需要8分钟。通过集成多个平行的微通道,能同时完成多个样品的除盐和富集,且整个样品预处理的时间仅需约15分钟,所消耗的溶剂量不到100μL。研究结果表明,建立的芯片与质谱联用的技术平台在新药开发过程中具有很大的应用潜力。
　　 4、设计了一个集成化的微流控芯片,可以同时进行高通量的细胞毒性筛选和ESI-Q-TOF质谱对药物吸收和代谢物的在线检测。微流控芯片由浓度梯度发生器、相应的细胞培养室微阵列、以及集成在芯片上的固相萃取柱构成。通过这个联合体系可以同时完成诸如液体的扩散和混合,细胞的培养、刺激、标记、药物的吸收以及代谢物的生成。实验中用抗癌药甲氨蝶呤为模型药物对该平台进行细胞凋亡、药物吸收和代谢物同时检测的可行性进行了评价。随着药物浓度的增加,细胞凋亡率呈剂量依赖正相关性。由于代谢物的含量超出了ESI-Q-TOF质谱的最低检测限,最终只检测到了药物在细胞内吸收的含量。细胞内吸收的药物浓度越高,细胞凋亡率越大。此外,本实验还设计了两种微通道构型,即三层微流控芯片和集成气动微阀,可以在一块微流控系统中完成两种功能单元的操作,为药物的自动化分析提供了良好的平台。

目录

文摘

英文文摘

Contents

符号及缩略词说明

第一章 微流控芯片上细胞相关的研究与进展

1.1 引言

1.2 微流控芯片在细胞生物学中的应用

1.2.1 微流控芯片上的细胞培养

1.2.2 微流控芯片上细胞的分选

1.2.3 微流控芯片上单细胞的分析

1.2.4 微流控芯片上基于细胞的生物模拟

1.3 微流控芯片的质谱检测方法

1.4 本课题的研究内容、目的及意义

第二章 微流控芯片上基于免疫磁珠法分选CD4+ T淋巴细胞

2.1 引言

2.2 实验部分

2.2.1 试剂和材料

2.2.2 微流控芯片的设计与制作

2.2.3 细胞样品的制备

2.2.4 在芯片外进行细胞分选

2.2.5 在芯片上细胞分选的操作步骤

2.3 结果与讨论

2.3.1 微流控芯片上磁珠的捕获

2.3.2 反应室尺寸对细胞捕获效率的影响

2.3.3 上样流速对细胞捕获效率的影响

2.4 本章小结与展望

第三章 微流控芯片上基于水凝胶包裹细胞的方法用于抗癌药物分析

3.1 引言

3.2 实验部分

3.2.1 试剂和材料

3.2.2 微流控芯片的加工与制作

3.2.3 细胞的培养

3.2.4 加工包裹细胞的水凝胶微阵列

3.2.5 细胞的活性测试

3.2.6 测定水凝胶包裹细胞内的谷胱甘肽和活性氧自由基的含量

3.3 结果与讨论

3.3.1 加工包裹多种不同细胞的水凝胶微阵列

3.3.2 水凝胶包裹细胞的活性测试

3.3.3 水凝胶包裹的HepG2和A549细胞内谷胱甘肽和活性氧自由基的同时测定

3.4 本章小结及展望

第四章 微流控芯片细胞培养及其与质谱联用技术用于细胞代谢物分析

4.1 引言

4.2 实验部分

4.2.1 试剂和材料

4.2.2 微流控芯片的加工与制作

4.2.3 细胞培养

4.2.4 微流控芯片上A549细胞中生育酚的代谢研究

4.2.5 生育酚代谢物的萃取以及ESI-Q-TOF的质谱检测

4.2.6 质谱条件

4.3 结果与讨论

4.3.1 微流控芯片设计以及与质谱的联用

4.3.2 微流控芯片细胞培养

4.3.3 芯片上固相萃取条件的优化

4.3.4 A549细胞内生育酚代谢物的质谱检测

4.4 本章小结及展望

第五章 集成化微流控芯片与电喷雾-四极杆-飞行时间质谱联用用于药物筛选研究

5.1 引言

5.2 实验部分

5.2.1 试剂和材料

5.2.2 微流控芯片的设计与制作

5.2.3 微流控芯片上的细胞培养

5.2.4 细胞凋亡检测

5.2.5 图像分析

5.2.6 细胞内代谢物的检测

5.2.7 质谱条件

5.3 结果与讨论

5.3.1 微流控芯片上稀释模型的表征

5.3.2 微流控芯片上的细胞培养

5.3.3 细胞凋亡的表征

5.3.4 HepG2和Caco-2细胞内甲氨蝶呤代谢物的检测

5.3.5 在一个微流控芯片设备上同时集成两个功能单元

5.4 本章小结与展望

第六章 结论

参考文献

致谢

研究成果及发表的学术论文

作者和导师简介

博士研究生学位论文答辩委员会决议书