交联脂肪酶聚集体(CLEAs)的制备及其粒径影响因素研究

摘要

作为一类新型的无载体固定化酶，交联酶聚集体以其制备方法简单、单位体积酶活高以及稳定性好等受到广泛的关注。目前对交联酶聚集体的研究主要集中在制备及其性能考察方面，但对交联酶聚集体粒径的调控及其对CLEAs性能的影响关注很少。然而，CLEAs的粒径大小不仅影响传质效率，还关系到CLEAs的稳定性，因此，粒径调控对CLEAs研究和应用来说至关重要。鉴此，本研究以假丝酵母脂肪酶（Candidasp.1619）为对象，探索并优化了其交联酶聚集体的制备条件，在此基础上通过不同调控手段得到了不同粒径的CLEAs，并研究了不同粒径CLEAs在性能方面的差异。主要研究结果如下:
　　 (1)利用无载体固定化酶技术，以三倍酶液体积的丙酮为沉淀剂，2.08％的戊二醛为交联剂，在交联时间为120min、交联温度20℃、离心转速为4000r·min-1时能得到活性和稳定性均较游离酶理想的CLEAs。
　　 (2)利用表面活性剂Tween-20和牛血清蛋白BSA对CLEAs进行改性，其活性分别提高了7％和22％。酶学性能分析显示，CLEAs最适pH值范围为6.0～9.0，在50℃下热处理2h能保留60％以上的活性，与游离酶相比稳定性得到了显著提高。对比CLEAs和游离酶的Km和Vmax分析发现，CLEAs对底物的亲和力较游离酶要弱，但单位时间内的催化效果要优于游离酶。
　　 (3)对影响CLEAs粒径因素分析表明，交联过程是决定粒径大小的关键步骤。在交联过程加入超声方式可使CLEAs粒径明显减小，但颗粒形状不明显;加入vortex方式或添加适量BSA可有效地将CLEAs粒径从151～180nm降低到19～26nm。同时，交联剂的分子量及其浓度越大，则制得的CLEAs粒径也相应增大。

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摘要

Contents

符号说明

第一章 文献综述

1．1 引言

1．2 酶的固定化

1．2．1 酶的固定化

1．2．2 有载体酶固定化方法

1．2．3 无载体酶固定化方法

1．3 交联酶聚集体

1．3．1 交联酶聚集体的定义

1．3．2 交联酶聚集体的制备

1．3．3 交联酶聚集体的性质

1．3．4 影响交联酶聚集体性质的因素

1．3．5 交联酶聚集体的应用及最新研究进展

1．4 交联酶聚集体的粒径

1．5 本课题的研究目的和意义

第二章 实验材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验仪器

2．1．2 实验药品

2．2 实验方法

2．2．1 交联酶聚集体的制备实验

2．2．2 交联酶聚集体的性能测定实验

2．2．3 交联酶聚集体反应动力学常数的测定实验

2．2．4 交联酶聚集体粒径影响因素实验

2．3 分析方法

2．3．1 酶蛋白含量的测定

2．3．2 酶活力的测定

2．3．3 交联酶聚集体结构表征

第三章 交联酶聚集体的制备

3．1 交联酶聚集体制备条件的优化研究

3．1．1 沉淀剂的选择

3．1．2 交联剂(戊二醛)浓度对交联酶聚集体活性的影响

3．1．3 交联时间对交联酶聚集体活性的影响

3．1．4 交联温度对交联酶聚集体活性的影响

3．1．5 离心转速的影响

3．2 交联酶聚集体性能优化研究

3．2．1 添加牛血清蛋白对交联酶聚集体活性的影响

3．2．2 添加表面活性剂对交联酶聚集体活性的影响

3．3 本章小结

第四章 交联酶聚集体的粒径影响因素及其性能研究

4．1 影响交联酶聚集体粒径的因素

4．1．1 vortex

4．1．2 超声

4．1．3 交联剂类型

4．1．4 交联剂浓度

4．I．5 添加BSA

4．2 粒径对交联酶聚集体性能的研究

4．2．1 粒径对交联酶聚集体活性的影响

4．2．2 粒径对交联酶聚集体稳定性的影响

4．2．3 粒径对交联酶聚集体反应动力学常数的影响

第五章 结论

参考文献

致谢

研究成果及发表的学术论文

作者和导师简介

硕士研究生学位论文答辩委员会决议书