表面电荷对纳微球佐剂效果的影响之细胞水平研究

摘要

目前疫苗佐剂的发展包括优化抗原至抗原提呈细胞(APCs)（如巨噬细胞）的递呈途径。纳微球作为佐剂成为近年来疫苗递呈系统研究的一大热点。本课题采用乙肝表面抗原为模型抗原，首次探讨了巨噬细胞对粒径均一的不同表面电荷聚乳酸(PLA)纳微球的摄取行为以及活化情况。
　　 首先利用快速膜乳化技术，制备得到了PLA纳微球，纳微球粒径均一性好、表面光滑、球形完整，其平均粒径为900 nm，其多分散性指数为0.029。
　　 然后将一定量PLA纳微球分别添加到1％(w/v)的壳聚糖(CS)、壳聚糖盐酸盐(CSC)以及聚乙烯亚胺(PEI)溶液中，利用静电作用直接对微球镀层，使纳微球的表面带有正电荷。SEM和粒径分布结果表明修饰后对PLA纳微球形貌、粒径分布和分散性没有影响，但是PLA、PLA-CS、PLA-CSC、PLA-PEI的表面电荷依次增高。其中PLA的平均电位为-21.3 mV，PLA-CS的平均电位为7.5 mV，PLA-CSC的平均电位为13.1 mV，PLA-PEI的平均电位为31.7 mV。
　　 表面电荷的增加，显著的提高了PLA微球对HBsAg的吸附效率。空白PLA微球对HBsAg的吸附率仅为3.89％，采用壳聚糖和壳聚糖盐酸盐修饰的PLA微球，对HBsAg吸附率分别为23.97％和58.68％，而聚乙烯亚胺修饰的PLA微球对HBsAg的吸附效率可高达62.63％。
　　 最后，采用三种巨噬细胞考察表面电荷对纳微球作为佐剂的效果影响。小鼠腹腔巨噬细胞的考察结果表明表面电荷的增加，有利于抗原的摄取，MHCⅠ和MHCⅡ的表达以及IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α这几种细胞因子的分泌，表明表面电荷的增加可更好的激活巨噬细胞，继而产生更强的免疫应答。

目录

声明

学位论文数据集

摘要

缩略词

第一章 绪论

1．1 本课题研究背景

1．1．1 乙肝现状

1．1．2 乙肝引起的免疫概述

1．1．3 治疗性乙肝疫苗的研究现状

1．1．4 疫苗佐剂概述

1．1．5 纳微球作为佐剂的研究现状

1．2 本课题的立题依据

1．3 本课题的研究内容、目的和意义

第二章 粒径均一可控的纳微球的制备和镀层修饰

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 微球的制备方法

2．2．3 纳微球表面形貌观察

2．2．4 纳微球粒径及分布测定

2．2．5 PLA纳微球PVA残留量测定

2．2．6 PLA纳微球的修饰

2．2．7 FITC标记抗原的制备

2．2．8 抗原吸附

2．2．9 乙肝表面抗原吸附率的测定

2．3 结果与讨论

2．3．1 所制备的粒径为900 nm微球

2．3．2 所制备的粒径为400 nm微球

2．3．3 PVA的残留量

2．3．4 修饰后PLA纳微球的表征

2．3．5 修饰后PLA纳微球对抗原的吸附率

2．4 本章小结

第三章 纳微球表面电荷对巨噬细胞系RAW 264．7行为的影响

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验仪器

3．2．3 CCK-8法测RAW 264．7细胞活力

3．2．4 巨噬细胞系RAW 264．7对抗原的吞噬实验

3．2．5 巨噬细胞系RAW 264．7表达的MHC Ⅰ、MHC Ⅱ、CD80和CD86

3．2．6 细胞因子的检测

3．2．7 抗原与溶酶体的共定位实验

3．3 结果与讨论

3．3．1 RAW 264．7细胞活力

3．3．2 RAW 264．7对抗原的吞噬效果

3．3．3 巨噬细胞系RAW 264．7表达的MHC Ⅰ、MHC Ⅱ、CD80和CD86结果

3．3．4 细胞因子的检测

3．3．5 共定位结果

3．4 本章小结

第四章 纳微球表面电荷对巨噬细胞系J774A．1行为的影响

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验仪器

4．2．3 巨噬细胞J774A．1对抗原的吞噬实验

4．2．4 巨噬细胞J774A．1表达的MHC Ⅰ和MHC Ⅱ的检测

4．3 结果与讨论

4．3．1 巨噬细胞J774A．1对抗原的吞噬结果

4．3．2 巨噬细胞J774A．1表达的MHC Ⅰ和MHC Ⅱ的

4．4 本章小节

第五章 纳微球表面电荷对原代小鼠腹腔巨噬细胞行为的影响

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 实验材料

5．2．2 实验仪器

5．2．3 小鼠腹腔巨噬细胞的提取

5．2．4 安全性实验

5．2．5 抗原摄取情况的研究

5．2．6 小鼠腹腔巨噬细胞表达的MHC Ⅰ和MHC Ⅱ的检测

5．2．7 细胞因子的检测

5．3 结果与讨论

5．3．1 小鼠腹腔巨噬细胞的存活率

5．3．2 流式细胞仪的定量分析结果

5．3．3 激光扫描共聚焦显微镜定性分析结果

5．3．4 小鼠腹腔巨噬细胞表达的MHC Ⅰ和MHC Ⅱ的结果

5．3．5 细胞因子分泌的结果

5．4 本章小节

第六章 结论与创新性

6．1 本论文主要结论

6．2 本论文创新性

第七章 问题与建议

参考文献

附录

致谢

研究成果及发表的学术论文

作者及导师简介