跨膜蛋白CD36跨膜区相互作用的分子机制研究

摘要

跨膜蛋白CD36是一类位于多种类型细胞表面上的B型清道夫受体，它在先天免疫，血栓形成，细胞粘附，以及脂质转运等方面均有至关重要的作用。为了比较全面的了解CD36介导的配体结合和信号转导机制，我们对CD36的结构及其跨膜区相互作用的分子机制进行研究。
　　CD36具有两个跨膜结构域，我们之前的实验结果表明它的第二个跨膜区没有明显的二聚作用。通过查询NCBI数据库我们发现CD36的第一个跨膜区(TM1)包含许多保守的甘氨酸残基。这些甘氨酸可能会以GxxxG基序的形式参与影响同源二聚作用。因此，本论文中主要研究CD36的第一个跨膜区。TOXCAT是一种用于定量检测细菌E.coli真实的内膜上跨膜螺旋自聚的方法。首先利用这种方法进行CD36跨膜区相互作用的研究，实验中以二聚作用最强的血型糖蛋白A(GpA)的CAT活性作为100％，检测得出CD36野生型(WT)的CAT活性为87.5％，说明其存在比较强的同源二聚作用。将残基G12，G16和A20突变成异亮氨酸(Ⅰ)，显著降低二聚作用。总体实验结果表明，G12xxxG16xxxA20基序对CD36跨膜域的二聚作用至关重要。
　　利用计算机进行跨膜多肽相互作用的模拟，突变G16I聚合时只出现右手-35°构象，N端距离为18埃左右，而G23I聚合时只出现右手-20°构象，N端距离为10埃左右。为了研究它们相互作用时的构象，通过Fmoc固相合成法分别合成N端连有一个色氨酸(W)与一个半胱氨酸(C)的四个多肽G16I-W，G16I-C，G23I-W，G23I-C。选取特异性与巯基反应的荧光基团mBBr
　　（单溴二胺）标记G16I-C和G23I-C，采用色氨酸诱导的荧光淬灭方法对跨膜多肽相互作用的构象进行研究。F0与FW分别代表色氨酸不存在与存在的情况下的整体荧光强度，荧光强度数据(F0/FW)取决于mBBr到色氨酸的Cα-Cα距离，即反映出两条多肽链相互作用时的构象。结果显示G16I跨膜多肽相互作用时Cα-Cα距离大于15埃，G23I相互作用时Cα-Cα距离为11埃，这与计算机模拟结果一致。
　　本论文通过对CD36的第一个跨膜区(TM1)相互作用的分子机制与构象进行研究，有助于进一步探究生物体内跨膜蛋白的功能与其相互作用机制之间的关系，给后续将CD36作为靶点的药物的研发提供理论基础。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 绪论

1．1 概述

1．1．1 CD36简介

1．1．2 CD36结构与功能

1．1．3 CD36与脂蛋白参与动脉粥样硬化病变

1．1．4 CD36作为潜在的治疗靶标

1．2 固相合成跨膜多肽及其纯化

1．2．1 固相合成多肽(SPPS)概述

1．2．2 多肽的纯化及鉴定方法

1．3 跨膜蛋白跨膜区的相互作用研究

1．3．1 概述

1．3．2 跨膜蛋白之问相互作用生物检测方法：TOXCAT

1．3．3 色氨酸诱导的淬灭方法(TrIQ)

1．4 课题研究意义与主要研究内容

1．4．1 课题研究意义

1．4．2 主要研究内容

第二章 实验部分

2．1 实验仪器及材料

2．1．1 实验仪器

2．1．2 实验试剂与材料

2．2 跨膜蛋白在生物体内相互作用的研究

2．2．1 TOXCAT

2．2．2 MaIE互补实验

2．2．3 蛋白免疫印迹(Western blot)

2．2．4 TOXCAT分析跨膜区突变嵌合体

2．3 跨膜区多肽合成和纯化

2．3．1 利用Fmoc固相合成跨膜多肽

2．3．2 多肽上连有的树脂的切除

2．3．3 荧光标记多肽

2．3．4 跨膜多肽粗品液相分析与鉴定

2．3．5 多肽的RP-HPLC分离与纯化

2．4 跨膜多肽相互作用的构象研究

2．4．1 样品的制备及浓度的标定

2．4．2 TrIQ检测

第三章 实验结果与分析

3．1 跨膜蛋白CD36 TM1的相互作用研究

3．1．1 TOXCAT检测

3．1．2 小结

3．2 跨膜多肽合成和分离纯化的研究

3．2．1 突变G16I多肽合成和纯化

3．2．2 突变G23I多肽合成和纯化

3．2．3 小结

3．3 CD36跨膜多肽相互作用的构象研究

3．3．1 G16I跨膜多肽的TrIQ分析

3．3．2 G23I跨膜多肽的TrIQ分析

3．3．3 小结

第四章 结论及展望

参考文献

致谢

研究成果及发表的学术论文

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