miR-192和miR-204转录后水平调控HOTTIP影响肝细胞癌的生长

摘要

肝细胞癌是世界上死亡率最高的癌症之一，长链非编码RNA HOTTIP是肝细胞癌的一个重要的原癌基因。然而，由HOTTIP的异常表达对HOTTIP在转录后水平和下游分子事件的调控作用仍未曾研究过。
　　首先我们预测了靶向HOTTIP的miRNA，通过实时定量PCR确定了miR-192和miR-204可以在肝细胞癌细胞系HepG2和SMMC7721中抑制HOTTIP的表达。miR-192和miR-204在许多癌症中都发挥着抑癌作用，在目前的研究中，我们确定了在肝细胞癌中miR-192和miR-204可通过AGO2介导的RNA干涉途径抑制HOTTIP的表达。通过双荧光素酶报告基因实验进一步确定miR-192和miR-204与HOTTIP之间的作用。同样，在肝细胞癌组织中也发现这两种miR-192和miR-204与HOTTIP存在负相关的关系。有趣的是，这三种非编码RNA的异常调节与肝细胞癌病人的总生存时间有关。此外，miR-192、miR-204或HOTTIP siRNA转录后可以沉默HOTTIP进而抑制肝细胞癌细胞的生长。内源性抑制miR-192和miR-204可使HOTTIP表达上调，促进细胞生长。通过转录组测序我们确定了除靶基因HOXA13外的19个基因，如谷氨酰胺基因，为miR-192/-204-HOTTIP的下游靶基因。谷氨酰胺是癌细胞的一个重要的标志物，我们检测到miR-192/204-HOTTIP可抑制谷氨酰胺的表达中断肝细胞癌的谷氨酰胺代谢，阻碍细胞生长。实验结果表明miR-192/-204-HOTTIP轴可能是肝细胞癌发生发展中的一条重要的分子通路。肝细胞癌临床标本的数据表明，miR-192，miR-204和HOTTIP与肝细胞癌的预后相关，且具有潜在治疗的作用。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 前言

1．1 miRNA的研究进展

1．1．1 miRNA概述

1．1．2 miRNA的生物发生

1．1．3 miRNA的调控

1．1．4 miRNA与靶基因的分子机制

1．1．5 miRNA与肿瘤

1．1．6 miR-192和miR-204在肿瘤中的研究进展

1．2 lncRNA的研究进展

1．2．1 lncRNA概述

1．2．2 lncRNA的生物学功能及其分子机制

1．2．3 lncRNA与肿瘤

1．2．4 HOTTIP简介及其在肿瘤中的研究进展

1．3 GLS简介及其在肿瘤中的研究进展

1．4 立题背景与研究意义

第二章 实验方法

2．1 实验材料

2．1．1 细胞系

2．1．2 实验试剂

2．1．3 实验仪器

2．1．4 实验所需溶液

2．1．5 引物和mimics

2．2 实验方法

2．2．1 细胞培养

2．2．2 瞬时转染

2．2．3 提取RNA

2．2．4 实时定量PCR检测miRNA的转染效率(polyA加尾法)

2．2．5 实时定量PCR检测mRNA的表达

2．2．6 双荧光素酶报告基因实验

2．2．7 细胞增殖实验

2．2．8 流式细胞术

2．2．9 克隆形成实验

2．2．10 划痕实验

2．2．11 亚细胞分离定位HOTTIP

2．2．12 基因表达谱

2．2．13 患者与组织分析

2．2．14 裸鼠移植瘤模型实验

2．2．15 数据分析

第三章 实验结果

3．1 生物信息学分析预测靶向HOTTIP的miRNA

3．2 确定靶向HOTTIP的miRNA

3．3 miR-192与miR-204在转录后水平调控HOTTIP

3．4 miR-192与miR-204抑制肝细胞癌细胞增殖

3．5 miR-192与miR-204可影响多个HOTTIP下游基因

3．6 在肝癌组织中miR-192、miR-204与HOTTIP负相关

3．7 在体内miR-192、miR-204可抑制肝细胞癌的生长

第四章 结论

参考文献

致谢

研究成果及发表的学术论文

作者和导师简介