植物叶绿体分裂蛋白ARC6和PDV2的表达、纯化与结晶

摘要

叶绿体是植物细胞中由双层膜包裹的一种细胞器，承担着影响植物生长和繁殖的重要生理功能。叶绿体通过分裂的方式进行增殖，分裂装置中有若干蛋白质以复合物的形式发挥功能。ARC6是位于叶绿体分裂位点处的单次跨内膜蛋白，N端朝向基质侧，而短小的C端在膜间隙中通过直接相互作用将PDV2募集到分裂位点，ARC6和PDV2的相互作用有效地将位于叶绿体内外的分裂装置联系起来，这一过程如何实现是目前的研究热点之一。
　　本论文成功构建了关于ARC6(646-801 aa)、PDV2(236-307aa)、ARC6(76-618aa)的克隆，通过将蛋白连接His标签或GST标签，我们成功将其在大肠杆菌内进行了表达和纯化，并获得了ARC6(646-801aa)和PDV2(236-307aa)的蛋白复合物。通过进行结晶实验，我们最终获得了6个可供晶体生长的池液条件，经过一系列的优化，我们最终在HR2-112-3＃条件下获得了高质量的蛋白晶体，并收集到了有效的衍射数据。之后我们成功制备了ARC6(646-801aa)的硒代甲硫氨酸衍生物蛋白，并获得了其晶体，也收到了有效的衍射数据，得到了晶体的相位信息。同时，本研究还对ARC6(674-801aa)和PDV2(280-307aa)进行了共结晶实验，以期望获得其蛋白复合物的结构，目前也已获得了1个条件的晶体。
　　对于ARC6(76-618aa)蛋白，我们获得了2个可以供晶体生长的池液条件，经过优化之后，目前获得了ARC6(76-618aa)已经优化好的晶体。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 ARC6和PDV2：叶绿体分裂装置的重要元件

1．1．1 本课题的研究意义

1．1．2 本课题的研究现状

1．2 重组蛋白纯化方法

1．2．1 亲和层析

1．2．2 亲和标签

1．2．3 凝胶过滤层析

1．3 蛋白晶体学

1．3．1 蛋白生长的原理

1．3．2 蛋白晶体的优化

第二章 ARC6和PDV2克隆的构建

2．1 简介

2．2 实验材料

2．2．1 质粒和菌株

2．2．2 主要试剂

2．2．3 培养基

2．2．4 主要仪器

2．3 构建克隆pETDuet-ARC6-PDV2

2．3．1 聚合酶链式反应扩增PDV2和ARC6基因

2．3．2 目的基因和载体的双酶切

2．3．3 连接

2．3．4 转化

2．3．5 重组子pETDuet-PDV2、pGEX6p-1-PDV2的鉴定

2．3．6 构建克隆pETDuet-ARC6-PDV2

2．4 构建关于PDV2的克隆

2．4．1 构建克隆pET28a-PDV2，pGEX6p-1-PDV2

2．4．2 构建克隆pET28a-sumo-PDV2

2．5 构建关于ARC6(76-618aa)的克隆

2．6 实验结果

2．7 小结

第三章 ARC6(646-801aa)和PDV2的表达与纯化

3．1 简介

3．2 实验材料

3．2．1 菌种

3．2．2 主要试剂

3．2．3 培养基

3．2．4 主要仪器

3．3 目的蛋白的表达与鉴定

3．3．1 目的蛋白的小量诱导表达

3．3．2 目的蛋白的试表达与纯化

3．3．3 亲和层析纯化方法

3．3．4 凝胶层析

3．3．5 亲和层析柱的处理

3．4 实验结果与讨论

3．4．1 小量诱导表达pETDuet-ARC6-PDV2

3．4．2 试表达pET28a-PDV2(236-307aa)

3．4．3 试表达pET28a-sumo-PDV2(236-307aa)

3．4．4 试表达pGEX6p-1-PDV2(236-307aa)

3．4．5 提高pGEX6p-1-PDV2(236-307aa)里目的蛋白的表达量

3．4．6 ARC6(646-801aa)和PDV2复合物的获得

3．5 小结

第四章 目的蛋白的结晶以及晶体衍射

4．1 简介

4．2 实验材料

4．2．1 主要试剂和材料

4．2．2 主要仪器

4．3 晶体优化方法

4．4 实验结果与讨论

4．4．1 晶体的发现与优化

4．4．2 Native晶体的获得

4．4．3 硒代晶体的获得

4．5 小结

第五章 ARC6(646-801aa)与PDV2(280-307aa)的共结晶

5．1 简介

5．2 实验材料

5．3 关于获得晶体复合物的一些实验

5．3．1 尝试获得ARC6(674-801aa)和PDV2(236-307aa)的复合物

5．3．2 GST-pull down

5．4 实验结果与讨论

5．4．1 ARC6(674-801aa)和PDV2(236-307aa)的复合物

5．4．2 GST-pull down的实验结果

5．4．3 ARC6(646-801aa)与PDV2(280-307aa)的共结晶

5．5 小结

第六章 ARC6(76-618aa)的纯化与结晶

6．1 简介

6．2 实验材料

6．3 实验结果与讨论

6．4 小结

第七章 结论与建议

参考文献

附录

致谢

作者和导师简介