免疫分析法在抗生素和蛋白质检测中的应用研究

摘要

近年来，随着畜牧业的快速发展，兽药的种类剧增且使用范围逐渐扩大，随之而来的动物源性食品中兽药残留问题严重威胁人类的健康，成为亟待解决的重要课题。蛋白质在生命活动过程中扮演着不可替代的角色，可作为生理功能处于正常或病理状态的客观评价指标物，复杂生物样品中蛋白质的分离与检测是蛋白质组学、诊断学及基因学等生命科学研究领域的关键技术。实际样品中兽药残留和蛋白质的分离与检测都面临着目标化合物含量低、样品基质复杂等挑战，因此，探索和发展快速高效的检测兽药残留和蛋白质的方法十分必要。
　　免疫分析法是一类以抗原-抗体之间特异性亲和结合为基础而建立的分析方法，该类方法具有特异性强、选择性好、灵敏度高等优良特性，已广泛应用于食品监测、药物检测、疾病诊断等领域中目标化合物的分离与检测。本文基于免疫分析法，建立了用于检测卡那霉素的生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法(BA-ELISA)和用于分离与富集牛血清白蛋白(BSA)的磁免疫亲和萃取-荧光光谱法(MIAE-FSA)。具体研究内容如下:
　　(1)制备了卡那霉素多克隆抗体，以生物素-亲和素放大系统为基础建立了BA-ELISA法，用于牛奶和蜂蜜中卡那霉素的检测。利用单因素分析法对BA-ELISA的实验条件进行了一系列的考察与优化。在最佳实验条件下，方法的线性范围为0.3-30 ng mL-1，检测限和定量限分别为0.07 ng mL-1和0.22 ng mL-1，IC50值为6.48 ng mL-1，对四种卡那霉素类似物的交叉反应率均小于1％。将BA-ELISA法应用于牛奶和蜂蜜实际样品中卡那霉素的分析检测，回收率介于91.0％和103.3％之间。将该BA-ELISA法的测定结果与LC-MS/MS法进行对比，两种方法呈现出较好的相关性(R2＞0.99)。上述结果表明，该方法展现出特异性强、灵敏度高和准确性好等优势，适用于牛奶和蜂蜜实际样品中卡那霉素的检测;
　　(2)制备了BSA多克隆抗体，建立了MIAE-FSA法，用于人血清样品基质中BSA的检测。实验通过水热法、溶胶-凝胶法和戊二醛偶联法成功制备了具有核壳结构的免疫磁球（IMMs），将其作为MIAE吸附剂用于BSA的分离与富集，并用FS进行检测。考察并优化抗体固定化条件，制备的IMMs具有良好的分散性、稳定性和磁响应性，抗体在磁球表面的最大固载量为32.2 mg g-1。通过优化MIAE条件，该方法对目标蛋白质的最大吸附量为107.7μg g-1，IMMs重复使用10次后，萃取效率保留了80％以上。将该方法应用于人血清样品基质中BSA的分离与检测，回收率大于89.3％，由基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪测得分离后的BSA纯度较高。上述结果表明，该方法展现出特异性强、分析速度快、可重复使用等优势，适用于人血清样品基质中BSA的分离与检测。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 抗生素

1．1．1 卡那霉素的简介

1．1．2 卡那霉素的理化性质

1．1．3 卡那霉素的应用

1．1．5 卡那霉素残留的危害

1．1．6 卡那霉素的限量标准

1．1．7 卡那霉素的检测方法

1．2 蛋白质

1．2．1 蛋白质的简介

1．2．2 蛋白质分离的意义

1．2．3 蛋白质的分离方法

1．3 免疫分析

1．3．3 抗原-抗体反应

1．4 酶联免疫吸附法

1．4．1 ELISA的原理

1．4．2 ELISA的分类

1．4．3 生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法(BA-ELISA)

1．5 免疫亲和萃取法(IAE)

1．5．2 抗体的固定化

1．5．3 磁免疫亲和萃取(MIAE)在蛋白质分离中的应用

1．6 课题提出

第二章 生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法用于牛奶和蜂蜜中卡那霉素的检测研究

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 试剂与材料

2．2．2 实验仪器

2．2．3 缓冲溶液配制

2．2．4 全抗原和包被抗原的合成

2．2．5 卡那霉素多克隆抗体的制备

2．2．6 卡那霉素多克隆抗体的纯化

2．2．7 生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法测定卡那霉素

2．2．8 液相色谱-串联质谱法(LC-MS／MS)测定卡那霉素

2．3 结果与讨论

2．3．1 卡那霉素多克隆抗体的表征

2．3．2 BA-ELISA条件优化

2．3．3 BA-ELISA方法学评价

2．4 小结

第三章 磁免疫亲和萃取-荧光光谱法用于检测牛血清白蛋白的研究

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 试剂与材料

3．2．2 实验仪器

3．2．3 缓冲溶液配制

3．2．4 BSA多克隆抗体的制备

3．2．5 抗体亲和常数的测定

3．2．6 免疫磁球的制备

3．2．7 荧光标记物的制备

3．2．8 磁免疫亲和萃取

3．3．2 免疫磁球合成条件的优化

3．3．3 抗体的最大固载量

3．3．4 磁性复合材料的表征

3．3．5 磁免疫亲和萃取条件的优化

3．3．6 材料的重复使用性考察

3．3．7 实际样品分析

3．4 小结

第四章 结论

参考文献

致谢

研究成果及发表的学术论文

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