抗生物被膜多肽的设计及活性机理研究

摘要

目前，医学临床上有超过65-80％的疾病都是由生物被膜感染引起，主要包括:慢性疾病、植入医学器械的导管感染等，这些都是临床上很难彻底治疗的疾病。细菌聚集发展成群体，随后形成的生物被膜，能够使细菌的抗药性增加10-1000倍不等，使得临床治疗更加棘手。虽然已经有抗生素协同联合抗生物被膜的治疗方法，但是抗生素协同的机制不明确使得协同效果不稳定。因此，具有高效广谱抗菌的抗菌肽是目前公认的最具有抗生物被膜潜力的新型药物。
　　本课题中，通过对有广谱高效抗菌活性的抗菌肽ZXR-2序列的优化，主要包括疏水力矩提升、带电量变化、序列长短等方面的优化，最终通过多肽二级结构的确定和生物活性的测定，得到有抗成熟生物被膜活性的多肽ZXR-2.3(FKILRFIKKLWRSLLA)。通过结晶紫染色法测定残留生物被膜和生物被膜中细菌致死实验判断ZXR-2.3的降解生物被膜能力及杀死生物被膜中细菌的能力，实验发现:ZXR-2.3在MIC浓度时杀菌和分解生物被膜的活性很明显，但是对生物被膜中细菌的致死能力强于其分解生物被膜的能力。
　　同时，将作用机制不同的IDR-1018(VRLIVAVRIWRR-NH2)和KT2(NGVQPKYKWWKWWKKWW-NH2)分别与ZXR-2.3协同降解生物被膜，其中加入环丙沙星抗生素进行协同实验的比较，因为有文章指出IDR-1018与环丙沙星抗生素的协同效果最好。其中，IDR-1018能够通过刺激诱导第二信号分子(p)ppGpp降解，导致生物被膜的完整性被破坏，从而使成熟生物被膜被降解。而KT2可以穿过细胞膜与胞内的DNA或其他小分子结合，以杀死细菌的方式降解成熟生物被膜。随后，通过结晶紫染色实验、成熟生物被膜MTT实验、生物被膜厚度变化，甚至动态培养成熟生物被膜实验发现:能在低浓度诱导生物被膜降解的IDR-1018与ZXR-2.3的协同性最好，可以同时降解分离生物被膜和杀死生物被膜细菌。研究分析发现:两种多肽降解生物被膜的作用机制能弥补协同多肽的不足，IDR-1018主要承担解离生物被膜的作用，而ZXR-2.3通过裂解破坏细胞膜杀死细菌，所以两者的协同性最好。多肽之间协同降解生物被膜是一种新的组合方式，将通过不同作用机制来降解生物被膜的多肽协同降解生物被膜，能更快速的找到降解生物被膜的有效方法。
　　最终，通过化学连接、linker连接等多种方法将ZXR-2.3和IDR-1018两条多肽连接成一条多肽，可同时具有降解成熟生物被膜和杀死生物被膜细菌的能力。
　　通过本课题的实验研究，不仅通过多肽序列设计获得了有降解成熟生物被膜能力的ZXR-2.3序列，而且继续通过多肽协同降解生物被膜实验发现:将降解成熟生物被膜作用机制不同且互补的两种多肽协同反应，是一种新的快速高效降解生物被膜的方法，为针对生物被膜引起的疾病进行临床治疗具有很大潜力。

目录

声明

摘要

符号和缩略词说明

第一章 绪论

1．1．1 生物被膜组成及形成过程

1．1．2 变形链球菌及其生物被膜

1．1．3 生物被膜抗抗生素

1．2 抗生物被膜多肽

1．2．1 乳铁蛋白抑制生物被膜形成

1．2．2 LL-37多肽抑制生物被膜形成

1．3 多肽优化方法

1．3．1 多肽活性影响因素

1．3．2 多肽改造方法

1．3．3 多肽KT2的优化改造

1．3．4 多肽IDR-1018的优化改造

1．3．5 多肽ZXR-2的优化改造

1．4 药物协同抗生物被膜

1．5 论文选题及意义

第二章 实验部分

2．1 实验仪器与试剂

2．1．1 实验仪器

2．1．2 实验试剂

2．2 实验方法

2．2．2 细胞毒性实验

2．2．3 最低抑菌浓度(MIC)测定

2．2．5 结晶紫定量法检测多肽对变形链球菌(S．mutans)生物被膜的影响

2．2．6 用MTT法检测多肽对成熟生物被膜中存活细菌量的影响

2．2．7 多肽物理协同处理成熟生物被膜实验

2．2．8 多肽对生物被膜形态的影响

2．2．9 多肽对生物被膜作用机制分析

第三章 实验结果与讨论

3．1 多肽序列的优化改造

3．1．1 二级结构分析优化结果

3．1．2 细胞毒性实验分析优化结果

3．1．3 多肽抑菌活性分析优化结果

3．2 抗生物被膜多肽的抑菌和杀菌活性

3．3 抗生物被膜多肽单独和协同作用对生物被膜的影响

3．3．1 降解成熟生物被膜

3．3．2 多肽协同处理成熟生物被膜

3．3．3 激光共聚焦观察生物被膜

3．3．4 生物被膜动态培养条件下的形态结构观察

3．4 化学连接多肽活性研究

第四章 结论与展望

参考文献

致谢

研究成果及发表的学术论文

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