基于LC-MS与单分子荧光的肉类中混合污染物的检测

摘要

在众多类别的动物源食品中，肉类产品占有重要的地位。鉴于混合污染物会在肉类产品的生产、贮存以及运输过程中不断累积，并经由食物链富集作用威胁人类健康，发展快速可靠的混合污染物的筛查方法对农业发展和食品安全有着重要的意义。
　　本实验建立了一种基于QuEChERs前处理方法，并利用LC-Q-TOF/MS检测鸡肉中126种农药残留的技术。该实验的主要步骤如下:(a)提取:以乙腈作为提取溶剂，采用先均质后振荡的提取方式提取鸡肉样品;(b)净化:通过比较添加不同的吸附剂组合(EMR-Lipid，PSA，C18，PSA+C18，PSA+C18+GCB)评估分散固相萃取(d-SPE)的净化效率;(c)色谱质谱检测:采用配有反相色谱柱的液相色谱和外标法进行检测。最终结果表明，EMR-Lipid是最适合的吸附剂，且超过90％的分析物达到低于10μg/kg的低检测限(LOQs)。在0.05，0.10和0.20mg/kg添加三个浓度上对回收率和相对标准偏差(RSDs)进行评估。在添加浓度为0.20mg/kg时，加标回收率在70-120％范围内，大多数农药的相对标准偏差(RSD)值小于15％。该方法中标准曲线的相关系数范围为0.9843（氟氯洛酮）至0.9999（环丙嘧啶）。该检测方法具有快速、高通量、高精度等优势，能够广泛应用于鸡肉中多种农药残留的检测。
　　此外，本实验建立了一种基于单分子荧光检测猪肉样品中PCB-77残留的技术。该实验的主要步骤如下:(a)玻片的修饰:将生物素和链霉亲和素分别修饰在玻片表面，用以固定核酸探针;(b)反应体系的设计:带有生物素标记捕获探针的能够固定在饰后的玻片表面，用于封闭捕获探针的适配体能与PCB-77特异性结合，当反应体系中存在PCB-77时，适配体将会从捕获探针脱离下来，此时，荧光探针能与暴露的捕获探针非稳态结合，从而产生荧光态的变化;(c)PCB-77的检测:采用全内反射显微镜观察单分子位点的荧光变化，根据单分子位点个数和体系中PCB-77的浓度绘制标准曲线，实现PCB-77的定量。最终结果表明，在缓冲溶液为2×PBS下，使用10nt的荧光探针时荧光态变化次数符合要求的位点的个数最多，核酸适配体价格低廉且具有良好的特异性。在优化完成的条件下，对猪肉实际样品中的PCB-77进行了添加回收试验，最终回收率范围在76.58％～103.63％。该检测方法能够有效地排除背景的干扰，进一步降低方法的检出限。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 混合污染物的现状

1．2．1 农药残留的现状

1．2．2 多氯联苯的现状

1．3 混合污染物检测的研究进展

1．3．1 农药残留的检测

1．3．2 多氯联苯的检测

1．4 核酸非稳态杂交在检测中的应用

1．5 课题研究内容以及选题意义

1．5．1 主要研究内容

1．5．2 研究成果及创新点

第二章 基于LC-MS多种农药残留检测方法的建立

2．1．1 试剂与耗材

2．1．2 实验仪器与设备

2．1．3 混标的配制

2．2．1 液相条件

2．2．2 质谱条件

2．2．3 PCDL数据库的建立

2．2．4 鸡肉前处理的优化

2．2．5 样品量的优化

2．2．6 萃取溶剂种类的优化

2．2．7 萃取溶剂用量的优化

2．2．8 萃取盐的组合的优化

2．2．9 净化剂的组合的优化

2．2．10 进样浓度的优化

2．3 方法确证

2．3．1 标准曲线与相关系数

2．3．2 基质效应

2．3．3 准确度与精密度

2．4 实验结果与讨论

2．4．1 LC-MS方法的建立

2．4．2 鸡肉前处理的优化结果

2．5 方法确证

2．6 本章小结

第三章 基于单分子荧光的PCB-77检测方法

3．1 实验材料及仪器

3．1．1 试剂与耗材

3．1．2 实验仪器与设备

3．1．3 寡核苷酸序列

3．2．1 核酸溶液的配制

3．2．2 核酸样品的制备

3．2．3 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(ND-PAGE)

3．3．1 荧光探针、捕获探针与核酸适配体的设计

3．3．2 利用全内反射显微镜观察单分子荧光位点

3．3．3 显微镜玻片表面的修饰

3．3．4 探针固定与目标物的捕获

3．3．5 单分子荧光传感与数据分析

3．3．6 荧光探针长度的优化

3．3．7 缓冲溶液浓度的优化

3．3．8 PCB-77适配体特异性的验证

3．3．9 实际样品的检测

3．4 实验结果与讨论

3．4．1 核酸适配体与PCB-77的亲和力的验证

3．4．2 基于单分子荧光对PCB-77的检测

3．4．3 本文检测方法与现有的PCB-77检测方法的比较

3．5 本章小结

第四章 总结与展望

4．1 主要结论

4．2 展望

参考文献

致谢

研究成果及发表的学术论文

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