基于Keap1/Hrf2-ARE信号通路的内源性基因编码ROS细胞传感器

摘要

机体在遭受到有害刺激时，细胞中会呈现氧化应激反应，而体内的活性氧簇(Reactive Oxygen Species，ROS)就是其中一个重要指标，当自由基水平超标，机体自身抗氧化清除能力不足，使得氧化-抗氧化系统失衡，进而造成机体氧化损伤。因此，实时动态检测活细胞内ROS变化显得尤为重要。目前，检测活细胞中ROS水平的方法有外源性和内源性两大方法体系，其中内源性探针有细胞毒性小、生物相容性好等优势，是目前ROS检测的发展趋势。Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Epoxy Chloropropane Kelch Sample related Protein-1，Keap1）/核因子E2相关因子2(Nuclear Factor Erythroid-2related Factor2，Nrf2)-抗氧化元件(Antioxidant Response Element，ARE)这样一条机体内内源性抗氧化信号通路可以改造后作为内源性检测ROS的一条新的途径。当机体内ROS水平处于生理状态时，Keap1蛋白质介导Nrf2蛋白质泛素化降解;当机体受到外界刺激导致ROS水平升高时，Nrf2不再被Keap1介导降解，而是进入细胞核内激活ARE序列下游的抗氧化基因来抵抗氧化应激带来的损伤。因此，本研究将构建在基因水平上依靠于Keap1/Nrf2-ARE通路的基因编码的ROS检测荧光生物细胞传感器，以期进行环境毒物对人体造成的ROS损伤和肿瘤细胞氧化损伤的检测。
　　本课题设计并构建成功基于Keap1/Nrf2-ARE信号通路的内源性ROS细胞传感器，并对其工作性能和应用进行了检测。首先，将该ROS细胞传感器的各个元件通过基因编辑构建于质粒表达载体，分别选取mCherry和mNeonGreen荧光蛋白作为响应信号分别构建两种ROS细胞传感器。采用外源添加H2O2的方式测试构建成功的细胞传感器的性能。结果表明:在H2O2外源刺激条件下，与mCherry相比，mNeonGreen作为响应信号的传感器具有更高的响应性。前人研究表明紫杉醇和白藜芦醇会导致细胞的ROS水平升高，因此选用紫杉醇和白藜芦醇进行该ROS细胞传感器的实际应用测试工作。结果表明:低浓度的紫杉醇会造成细胞的ROS水平升高;白藜芦醇的浓度与荧光信号的灵敏度成正比例，高浓度的白藜芦醇会升高ROS水平。此外，将构建好的ROS细胞传感器转入白血病细胞HL-60中对其氧化损伤进行检测，实验表明肿瘤细胞的生理ROS水平比正常人体细胞高，高浓度H2O2外源刺激下，该ROS细胞传感器荧光信号显现的更明显。
　　本研究具有良好的发展前景，可以通过荧光信号的量化，将其与ROS升高水平相关联，进行外源刺激与ROS的定量研究;可以将其应用于其他肿瘤细胞中，进一步推进肿瘤的检测工作;此外，Keap1/Nrf2-ARE信号通路在人体内氧化-抗氧化系统中具有重要意义，但仍有许多机制仍旧未知，本实验也为其工作机制的深入研究提供了一些基础性工作。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 活性氧簇(Reactive Oxygen Species，ROS)

1．2 ROS检测的重要意义

1．3 ROS的检测手段

1．3．1 roGFP(Reduction-oxidation-sensitive Green Fluorescent Protein)家族

1．3．2 rxYFP家族

1．3．3 Redoxfluor(Genetically Encoded Fluorescence Resonance Energy Transferprobe)

1．3．4 cpYFP

1．3．5 Hyper系列内源性细胞传感器

1．3．6 Redox特异敏感型的量子点探针

1．3．7 常见的外源性ROS检测探针

1．4 基因编码内源性细胞传感器的应用以及优势

1．5 293T细胞中ROS检测的重要意义

1．6 ROS是白血病检测的细胞水平标志物

1．7 Keap1/Nrf2-ARE信号通路

1．7．2 Nrf2(Nuclear Factor Erythroid-2 related Factor 2，核因子E2相关因子2)

1．7．3 ARE(Antioxidant Response Element，抗氧化反应元件)

1．7．4 Keap1/Nrf2-ARE信号通路的反应机制

1．8 课题研究内容以及选题意义

1．8．1 课题主要研究内容

1．8．2 研究成果及创新点

第二章 基于Keap1/NRF2-ARE信号通路的内源性基因编码ROS细胞传感器的构建

2．1 引言

2．2 内源性基因编码ROS细胞传感器的设计

2．3 实验材料及仪器

2．3．1 实验试剂与材料

2．3．2 实验仪器与设备

2．4 元件序列

2．5 实验方法

2．5．1 pLVX-5XARE-hCMVmp-mCherry-Puro质粒构建

2．5．2 pLVX-Keapl-T2A-EGFP-T2A-Nrf2-Puro质粒构建

2．5．3 pLVX-5XARE-hCMVmp-mNeonGreen-Puro质粒构建

2．5．4 pLVX-Keap1-T2A-mCherry-T2A-Nrf2-Puro质粒构建

2．5．5 潮霉素(HygR)替代嘌呤霉素(Puro)

2．6 实验结果与讨论

2．6．2 载体检测电泳结果

2．6．3 质粒构建成功

2．7 本章小结

第三章 基于Keap1/Nrf2-ARE信号通路的内源性基因编码ROS细胞传感器初步评估

3．1 引言

3．2 实验材料与仪器

3．2．1 实验试剂与材料

3．2．2 实验仪器与设备

3．3 实验方法

3．3．1 293T细胞的培养方法

3．3．3 Poly-fector试剂瞬时转染实验

3．3．4 l(i)po3000转染试剂瞬时转染实验

3．3．5 H2O2外源刺激实验

3．3．6 Cytation活细胞成像实验

3．3．7 流式细胞仪统计实验

3．4 实验结果与讨论

3．4．1 50μM H2O2处理实验组以及对照组1实验现象和推论

3．4．2 100μM H2O2处理实验组以及对照组1实验结果和推论

3．4．3 500μM H2O2处理实验组以及对照组1实验现象和推论

3．4．4 1 mM H2O2处理实验组以及对照组1

3．4．5 对照组2实验现象和推论

3．4．6 对照组3实验现象和推论

3．4．7 对照组4实验现象和推论

3．4．8 流式细胞仪统计

3．5 本章小结

第四章 基于Keap1/Nrf2-ARE通路的内源性基因编码ROS细胞传感器稳转细胞系的构建、筛选和检测

4．1 引言

4．2 实验材料和仪器

4．2．1 实验试剂和材料

4．2．2 实验仪器与设备

4．3 实验方法

4．3．3 病毒包装

4．3．4 病毒收集

4．3．5 病毒浓缩

4．3．6 病毒侵染

4．3．7 细胞冻存和复苏

4．3．8 H2O2评估稳转细胞系实验

4．3．9 紫杉醇(Paclitaxel，Px)药物刺激实验

4．3．10 白藜芦酉g(Resveratrol，RV)药物刺激实验

4．4 实验结果与讨论

4．4．1 病毒包装检测

4．4．2 稳转细胞系获得

4．4．3 H2O2评估稳转细胞系实验检测

4．4．4 紫杉醇(Paclitaxel)药物刺激实验

4．4．5 白藜芦醇(Resveratrol，RV)药物刺激实验检测

4．5 本章小结

第五章 基于Keap1/Nrf2-ARE信号通路的内源性ROS细胞传感器在白血病细胞中的应用

5．1 引言

5．2 实验材料及仪器

5．2．1 实验试剂与材料

5．2．2 实验仪器与设备

5．3 实验方法

5．4．1 500μM H2O2外源刺激实验结果

5．4．2 1.0 mM H2O2外源刺激实验结果

5．5 本章小结

第六章 结论与展望

参考文献

致谢

研究成果及发表的学术论文

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