分子对接方法及HIV整合酶抑制剂的设计研究

摘要

蛋白质分子是生命活动的重要物质，它与包括自身在内的生物分子的相互作用是生命自组织复杂体系得以正常调控运转的分子基础，一直备受生命科学领域的关注，是二十一世纪生命科学研究的前沿与热点。继人类基因组计划之后，生命科学已经进入功能基因组时代，以蛋白质聚集体间相互作用与识别为核心内容的蛋白质组学研究迅速兴起，已被广泛应用于生命科学的许多领域，具有举足轻重的战略地位。 随着计算机处理能力的不断增强，理论模拟方法也得到了迅速发展和广泛应用。采用分子对接方法进行蛋白质复合物结构预测，已成为蛋白质聚集体间相互作用和识别研究的有力手段，并可为实验工作提供有益的理论指导。如何得到更多正确的对接结构，然后如何有效快速地筛选出近天然结构，仍然是蛋白质-蛋白质对接方法学所面临的关键问题和挑战。所以，本论文的第一部分工作围绕蛋白质-蛋白质对接方法学研究上的两个主要难点，进行深入的研究和探讨。 在蛋白质结构和功能的研究中，发现许多蛋白与疾病的发生和防治相关，是新药研发的理想靶标。在艾滋病的病原体人体免疫缺陷病毒(HIV)复制过程中，有三种酶起着关键作用。其中，整合酶负责将病毒cDNA整合到宿主细胞的DNA中，而且在人体正常细胞中并无其功能的类似物，是研发抗HIV药物的一个非常有意义的靶点。由于整合酶蛋白的溶解度小，全酶的晶体结构一直没有获得，而且受整合酶体外抑制剂筛选实验的限制，使得整合酶靶向药物设计进展缓慢，到目前为止还没有整合酶抑制剂上市。因此，本论文的第二部分工作以HIV整合酶为研究对象，采用计算机辅助药物设计方法进行了HIV-1整合酶抑制剂的设计、改造和虚拟筛选。在此基础上，为了进一步获得有活性的HIV-1整合酶抑制剂，积极筹建酶学测活方法平台，开展了HIV-1整合酶的表达和纯化等生化实验工作(见论文第三部分)。 本论文主要内容包括以下三个部分：1.蛋白质-蛋白质对接方法的研究发展了基于结合位点信息的蛋白质-蛋白质分子对接方法。本工作在FTDock分子对接程序基础上，把蛋白质的结合位点信息整合到分子对接几何采样的旋转平移过程中。对10个目标复合物的对接预测结果显示，该方法可以获得更多的近天然结构，而且最优对接结构的配体均方根偏差(RMSD)也有明显的降低。同时，通过多构象叠合的方法在分子对接中考虑蛋白质复合物的主链柔性，提高了分子对接的效果。 提出了基于蛋白质-蛋白质复合物类型的组合打分函数。根据复合物的界面性质，将64个复合物划分为四种类型，即蛋白酶/抑制剂、抗原/抗体、其它酶/抑制剂和其它类型复合物。该打分函数组合了蛋白质复合物形成过程中的各种能量，包括界面残基成对偏好性(RP)、去溶剂化自由能(ACE)、静电相互作用以及范德华相互作用，应用多元线性回归方法来拟合组合函数的各项权重。结果显示，基于复合物类型的组合打分函数明显地提高了单独能量项对近天然结构的评价能力，对蛋白酶/抑制剂、抗原/抗体和其它酶/抑制剂复合物的对接结果较一些常用的打分函数的评价能力有明显的改善和提高。 2.HIV-1整合酶抑制剂的设计研究对一类具有较高活性和特异性的整合酶抑制剂——苯乙烯基喹啉类衍生物(SQLs)进行三维定量构效关系(3D-QSAR)及其与整合酶的结合模式研究，并进行了合理的结构改造。采用了比较分子场分析方法(CoMFA)，得到了一组能够较好预测SQLs抑制活性的CoMFA模型，并给出了影响这类化合物生物活性的相关结构信息。对接结果显示，SQLs的喹啉环上7-位羧基和8-位羟基与靶酶活性区域中镁离子形成鳌合作用；预测的结合能与抑制剂的活性也有很好的线性关系。基于上述结果，采用从头药物设计方法对该类抑制剂进行了合理的结构改造和设计，并进行分子对接模拟和聚类分析，获得了在已知SQLs中没有的4类新化合物结构。 同时，运用计算机模拟方法对界面多肽抑制剂进行了突变设计研究。基于整合酶二聚体的模建结构，采用分子动力学模拟方法分析二聚体间的相互作用，提取界面肽段与整合酶单体的作用信息。基于界面多肽抑制剂(α1和α5螺旋)进行虚拟残基突变，并对设计的多肽分子的二级结构以及其与整合酶单体的作用模式进行预测。结果显示，与α1和α5的螺旋性和结合能相比，部分设计的多肽分子的螺旋性和结合能有明显改进。 另外，还进行了数据库虚拟筛选，用来寻找新的整合酶抑制剂。在筛选中，基于整合酶核心结构域的三维结构，采用DOCK4.0程序，对ACD、MDDR、NCI小分子数据库(约258万个化合物)和中国草药数据库(约1万个化合物)进行计算机虚拟筛选。对筛选出来的小分子进行聚类分析和类药性评价，提出可能有抑制整合酶活性的化合物结构。最后，选取了打分排序和类药性较好的7个化合物分子并委托公司进行合成，相关的抗整合酶活性和抗病毒活性的实验正在进行中。 3.HIV-1整合酶的表达和纯化研究为了建立整合酶酶联免疫检测法(ELISA)并进行体外抑制剂的筛选，完成了HIV-1整合酶的表达和纯化工作。本论文以HIV-1B亚型国际标准株pol基因为模板克隆出整合酶基因，将其插入pET28a(+)原核表达载体。通过重叠PCR方法对第185位苯丙氨酸突变为赖氨酸，构建了重组质粒pET28a(+)/IN(F185K)，在体外大肠杆菌表达系统中以包涵体形式表达整合酶。通过对包涵体变性后，利用钴离子亲和层析柱纯化，获得了纯度达85％以上的整合酶蛋白。对整合酶进行复性，采用ELISA实验检验复性后的整合酶蛋白具有3’-末端链和链转移反应活性。通过本实验工作的进行，构建以蛋白为靶点的抑制剂筛选研究平台，为将理论设计与实验检验相结合进行整合酶抑制剂的筛选工作奠定了良好的基础。同时，通过本实验工作的进行，构建以蛋白为靶点的抑制剂筛选研究平台，为将理论设计与实验检验相结合进行整合酶抑制剂的筛选工作奠定了良好的基础。

目录

文摘

英文文摘

独创性声明及关于论文使用授权的说明

第1章绪论

1.1蛋白质-蛋白质对接方法的研究意义和进展

1.1.1分子对接的基本原理

1.1.2蛋白质-蛋白质对接方法的研究进展

1.2计算机辅助药物设计的基本理论和方法

1.2.1计算机辅助药物设计的基本理论

1.2.2常用的计算机辅助药物设计方法

1.3 HIV整合酶抑制剂的研究意义和研究进展

1.3.1抗HIV药物的研究意义和研究进展

1.3.2 HIV整合酶抑制剂的研究进展

第2章蛋白质-蛋白质对接方法的研究

2.1基于结合位点信息的蛋白质-蛋白质对接方法

2.1.1计算方法

2.1.2结果与讨论

2.2基于蛋白质复合物类型的组合打分函数

2.2.1对接体系和方法

2.2.2结果与讨论

2.3本章小结

第3章HIV-1整合酶抑制剂的设计研究

3.1苯乙烯基喹啉类整合酶抑制剂的3D-QSAR和结合模式的研究

3.1.1计算方法

3.1.2结果与讨论

3.2苯乙烯基喹啉类抑制剂的改造研究

3.2.1计算方法

3.2.2结果讨论

3.3整合酶二聚体的相互作用和界面小肽抑制剂的设计研究

3.3.1体系和方法

3.3.2结果与讨论

3.4基于整合酶结构的计算机虚拟筛选

3.4.1体系和方法

3.4.2结果与讨论

3.5本章小结

第4章HIV-1整合酶的表达和纯化

4.1材料与方法

4.1.1实验材料

4.1.2实验方法

4.2实验结果与讨论

4.2.1整合酶DNA片段的扩增和鉴定

4.2.2重组表达质粒的构建及鉴定

4.2.3整合酶基因在大肠杆菌中的表达

4.2.4表达产物的纯化

4.2.5整合酶融合蛋白的功能研究

4.3本章小结

第5章结束语

5.1论文工作总结

5.2论文创新点

5.3展望

参考文献

附录1FTDocd算法介绍

附录2界面残基成对偏好性

附录3组合打分函数与对接构象的L-RMSD之间的相关性

附录4整合酶抑制剂的药效团模型

附录5用于虚拟筛选的抑制剂化合物训练集

攻读博士学位期间所发表的学术论文和软件著作权

致谢