两种亚硝基脲导致DNA股间交联的理论与实验研究

摘要

亚硝基脲作为一种化疗药物在临床上被广泛应用，但是几乎所有的亚硝基脲在治疗肿瘤的过程中均可能导致二次肿瘤的产生，这一问题严重影响了亚硝基脲的应用和进一步研发。亚硝基脲的抗癌与致癌机理是非常接近的，都能够使DNA碱基发生烷化，进一步形成DNA股间交联。因此，研究亚硝基脲的致癌作用机理与抗癌作用机理之间的异同有着重要的意义。本课题主要通过生物化学和分子生物学方法检测了亚硝基脲所导致的DNA股间交联，并利用量子化学计算方法研究了亚硝基脲的β-位活性、分解机理及其鸟嘌呤烷化产物的稳定性。 亚硝基脲的生物化学和分子生物学研究，主要是以两种亚硝基脲抗癌药物司莫司汀(Me-CCNU)和尼莫司汀(ACNU)为研究对象，利用琼脂糖凝胶电泳方法和荧光方法研究了Me-CCNU和ACNU对DNA的交联作用。琼脂糖凝胶电泳方法主要研究Me-CCNU所导致的pBR322质粒DNA的交联率与反应时间的关系以及交联程度与药物浓度之间的关系；荧光方法是根据荧光染料Hoechst 33258与DNA双链结合激发荧光而不能够与DNA单链结合的性质，研究。Me-CCNU和ACNU对小牛胸腺DNA的交联作用。在研究了两种药物在不同溶剂中的水解情况之后，确立了荧光实验的反应条件，并在此条件下研究不同药物浓度与不同浓度DNA作用后交联率随反应时间的变化关系。发现了药物与DNA作用的初始阶段存在“诱导期”，是交联产生的必经阶段，得到了药物与DNA作用后8小时内交联率的变化规律。 亚硝基脲的量子化学计算研究，采用Gaussian A03和GaussView软件，在SR870BH2服务器上对氯乙基亚硝基脲化合物β-位反应活性、三种分解机理及其对DNA鸟嘌呤碱基的六种烷化产物进行了计算。利用从头算方法在RHF/6-311G(d，p)基组上对所有反应物、过渡态和中间体进行了全几何构型优化，使用STQN法确定反应过渡态结构。在相同计算水平上对优化后的分子结构进行频率分析，同时运行IRC以确认相关结构之间的关系。通过提取和评价分子结构参数及能量参数以确定亚硝基脲β-位邻基参与过程对交联的重要作用、亚硝基脲三种分解机理的活化能以及鸟嘌呤烷化产物的稳定性。该研究结果可为进一步阐明药物与DNA的作用方式提供理论依据。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章绪论

1.1研究背景

1.2亚硝基脲类抗癌药物的研究进展

1.3氯乙基亚硝基脲的分解机理

1.4氯乙基亚硝基脲与DNA的作用机理

1.4.1 DNA烷化加合物

1.4.2 DNA股间交联

1.5双区理论对亚硝基脲的解释

1.6课题研究目的和内容

第2章亚硝基脲导致DNA交联的电泳检测

2.1前言

2.2实验试剂和仪器

2.2.1实验试剂

2.2.2实验仪器

2.3实验方法与步骤

2.3.1细菌的接种与培养

2.3.2质粒的提取

2.3.3酶切反应

2.3.4 Me-CCNU与酶切pBR322质粒反应

2.3.5双链DNA变性淬火条件

2.3.6琼脂糖凝胶电泳检测

2.3.7 Me-CCNU在Tris中孵育不同时间后与DNA作用

2.4结果与讨论

2.4.1大肠杆菌中提取质粒DNA

2.4.2质粒的酶切

2.4.3线性DNA的变性淬火

2.4.4 Me-CCNU导致DNA交联的电泳检测

2.4.5 Me-CCNU在Tris中孵育不同时间后与DNA作用

2.5本章小结

第3章亚硝基脲导致DNA交联的光谱法检测

3.1前言

3.2实验试剂和仪器

3.2.1实验试剂

3.2.2实验仪器

3.3实验方法

3.3.1 Me-CCNU与ACNU的质谱检测

3.3.2 Me-CCNU与ACNU标准曲线的绘制

3.3.3 Me-CCNU与ACNU水解动力学的测定

3.3.4荧光实验条件的确立

3.3.5荧光分光光度法检测DNA交联

3.4实验结果

3.4.1 Me-CCNU与ACNU·HCl的质谱检测

3.4.2药物标准浓度曲线的绘制

3.4.3药物水解动力学测定

3.4.4荧光实验条件的确立

3.4.5荧光分光光度法检测DNA交联

3.5本章小结

第4章氯乙基亚硝基脲的量子化学计算

4.1概述

4.2理论基础

4.2.1从头计算法

4.2.2密度泛函方法

4.3过渡态理论

4.4 Gaussian03计算软件

4.5亚硝基脲化合物的量化计算研究

4.5.1亚硝基脲β-位抗癌活性的量化计算研究

4.5.2氯乙基亚硝基脲分解机理的量子化学计算

4.5.3氯乙基亚硝基脲对鸟嘌呤碱基的烷基化

4.6本章小结

结论

参考文献

攻读硕士期间所发表的学术论文

致谢