氯乙基亚硝基脲导致DNA股间交联的实验研究

摘要

氯乙基亚硝基脲(CENUA)是临床上重要的烷化剂类抗癌药物，但同时也具有致癌副作用，能够引起二次肿瘤的产生。一系列的研究表明无论是亚硝基脲的抗癌作用还是致癌副作用都与DNA股间交联的形成有关。因此，研究药物导致的DNA交联对揭示亚硝基脲的抗癌机理及其抗癌作用与致癌作用之间的差异有着重要的意义。 本文通过生物化学、分子生物学方法研究了亚硝基脲导致DNA交联的作用程度和交联率的变化趋势。分别用琼脂糖凝胶电泳和荧光方法对氯乙基亚硝基脲导致的DNA股间交联进行了定性和定量分析。首先，通过琼脂糖凝胶电泳分别检测了司莫司汀(Me-CCNU)和卡莫司汀(BCNU)对pBR322质粒DNA、PCR扩增DNA的交联作用。结果表明，Me-CCNU导致的DNA交联率随着反应时间的增长而逐渐增加，6～8个小时左右达到最大值。而DNA与BCNU反应时发生断链，并且断链的数量随着反应时间的增长而增多，链的长度也逐渐变短。其次，利用荧光染料与DNA双链结合后激发荧光的性质来检测Me-CCNU和BCNU对小牛胸腺DNA的交联。先测定了Hoechest33258荧光染料的激发和发射波长以及与荧光强度对应的DNA浓度的线性范围，并实时检测了DNA的淬火过程，从而确定了实验条件。对1mM、2mM、4mM的Me-CCNU和BCNU导致的小牛胸腺DNA交联进行荧光检测，同时紫外扫描Me-CCNU和BCNU在水中的分解情况，结果表明，氯乙基亚硝基脲的浓度对其导致的DNA交联率有显著影响，浓度越大交联率越高，但不同亚硝基脲对DNA交联率随时间的变化趋势存在明显的差异。Me-CCNU在反应初始阶段存在一段交联率较低的“诱导期”，而后交联率经历快速上升阶段最终在8小时左右达到稳定的最大值。BCNU导致的交联率则没有“诱导期”，由于分解较快使得DNA的单碱基烷化产物迅速增多从而推动了交联反应的进行，其经过快速上升后达到最大值，BCNU对DNA的交联率在反应后期有明显的下降趋势说明BCNU可能导致了DNA断链。在荧光分光光度法基础上建立了基于实时荧光定量PCR仪的DNA交联检测方法，并分别检测了Me-CCNU、BCNU和ACNU导致的DNA随反应时间变化的交联率。得到了相比荧光分光光度法有更小误差更稳定趋势的交联率曲线，进一步验证了氯乙基亚硝基脲类药物导致的DNA交联率随反应时间变化趋势，同时表明此方法是一种更加简便、高效、稳定的检测DNA交联的方法。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章绪论

1.1研究背景

1.2氯乙基亚硝基脲研究概况

1.2.1亚硝基脲的基本结构

1.2.2氯乙基亚硝基脲的基本结构和性质

1.2.3氯乙基亚硝基脲类药物

1.3氯乙基亚硝基脲类药物的作用机理

1.3.1氯乙基亚硝基脲的分解机制

1.3.2氯乙基亚硝基脲的烷化和交联作用

1.4 DNA交联的检测方法概况

1.5本课题研究内容

第2章电泳检测氯乙基亚硝基脲导致的DNA交联

2.1前言

2.2实验试剂和仪器

2.2.1实验试剂

2.2.2实验仪器

2.3实验方法与步骤

2.3.1酶切质粒DNA电泳

2.3.2 PCR扩增DNA电泳

2.4结果与讨论

2.4.1质粒的酶切

2.4.2线性DNA的变性条件

2.4.3 Me-CCNU和BCNU导致质粒DNA交联的电泳检测

2.4.4 Me-CCNU和BCNU导致PCR扩增DNA交联的电泳检测

2.5本章小结

第3章荧光法检测氯乙基亚硝基脲导致的DNA交联

3.1荧光分析法概述

3.2实验试剂和仪器

3.2.1实验试剂

3.2.2实验仪器

3.3实验方法

3.3.1确定Hoechst 33258染料激发和发射波长

3.3.2测定荧光强度与DNA浓度的关系

3.3.3荧光强度随时间的变化

3.3.4交联DNA淬火过程的检测

3.3.5荧光分光光度法检测DNA交联

3.3.6 Me-CCNU与BCNU分解的测定

3.3.7检测不同浓度药物导致的DNA交联率

3.4实验结果与讨论

3.4.1Hoechst 33258染料激发和发射波长

3.4.2荧光强度与DNA浓度的关系

3.4.3样品荧光强度随时间的变化

3.4.4交联DNA的淬火过程

3.4.5荧光法检测Me-CCNU和BCNU导致的交联

3.4.6不同浓度药物导致的交联

3.5本章小结

第4章 荧光定量PCR方法检测DNA股间交联

4.1荧光实时定量PCR(Fluorescence Real Time Quantitative PCR)

4.2实验仪器和试剂

4.2.1实验仪器

4.2.2实验试剂

4.3实验方法和步骤

4.3.1荧光染料的选择

4.3.2 DNA变性过程的实时荧光检测

4.3.3实时荧光定量PCR仪检测药物导致的DNA交联

4.4实验结果和讨论

4.4.1荧光染料的选择

4.4.2 DNA变性过程的实时检测

4.4.3荧光定量PCR仪检测药物导致的DNA交联

4.5本章小结

结论

参考文献

攻读硕士期间所发表的学术论文

致 谢