氯乙基亚硝基脲导致DNA股间交联的检测分析

摘要

氯乙基亚硝基脲（CENUs）是临床上一类重要的抗癌烷化剂，该类药物在发挥抗癌作用的同时能够诱发白血病等二次肿瘤的产生，其致癌副作用不容忽视。研究表明其抗癌和致癌机制均与导致DNA股间交联有关。因此，研究药物导致的DNA交联能够为CENUs抗癌与致癌作用之间的差异提供参考，对癌症的预防和治疗具有不可忽视的重要意义。本课题以此为出发点研究CENUs导致DNA股间交联的作用程度和交联率的变化趋势。主要采用变性凝胶电泳、荧光方法和高效液相色谱.质谱联用（HPLC-MS）方法对CENUs导致的DNA股间交联进行定性和定量检测分析。
　　 首先，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（dPAGE）检测司莫司汀（Me-CCNU）与DNA的股间交联。四种不同GC含量（0％、38％、54％和76％）的合成DNA与Me-CCNU反应的交联产物经dPAGE进行分离，电泳结果显示经Me-CCNU作用的GC含量为0％的DNA没有股间交联，而其它三种DNA中均有交联生成，表明Me-CCNU能导致GC碱基对交联，而不能导致AT碱基对交联。该方法操作简单，但灵敏度较低，无法检测交联率，仅适用于定性分析。因此，又使用了灵敏度更高的实时荧光方法进行定量分析。
　　 然后，使用实时荧光法研究了不同浓度的司莫司汀（Me-CCNU）、卡莫司汀（BCNU）和尼莫司汀（ACNU）导致λDNA交联的情况。结果表明Me-CCNU和ACNU对λDNA的交联反应初期均存在一个交联率上升缓慢的“诱导期”，“诱导期”后交联率随反应时间明显上升，在8小时左右达到稳定的最大值。BCNU导致的交联率则没有“诱导期”，由于分解较快使得DNA的单碱基烷化产物迅速增多从而推动了交联反应的进行。BCNU对DNA的交联率在反应后期有明显的下降趋势说明BCNU可能导致了DNA断链。实时荧光法与荧光分光光度法相比检测更加迅速，从而避免了由于测量时间长导致荧光强度衰减而引起的误差，因此是一种简便、高效、稳定的DNA交联检测方法。
　　 最后，使用高效液相色谱-电喷雾串联质谱（HPLC-ESI-MS/MS）联用方法对Me-CCNU导致DNA股间交联的产物进行检测。由于通过荧光方法测得的交联率是交联DNA双链的含量，而一条交联双链中可能含有多个交联的碱基对，为了从本质上探讨交联率的变化规律，我们使用HPLC-ESI-MS/MS联用方法对Me-CCNU导致DNA股间交联的碱基对进行了定量分析检测。首先将与亚硝基脲反应后的DNA样品经过酶解和离心过滤得到单个核苷，然后经反相色谱分离。使用质谱的选择反应扫描（Selecting Reaction Monitoring，SRM）模式监测。m/z521→m/z289的离子通道，对HPLC中分离出来的dG-dC交联进行定量分析。经过计算，得到了每107个碱基对中生成dG-dC交联的个数。结果表明，GC含量分别为38％、54％和76％的DNA双链中交联率均随反应时间呈上升趋势，并且均可以明显看到“诱导期”的存在。此外，DNA双链中GC含量越高，在相同反应时间和相同药物浓度下，生成的dG-dC交联越多，表明CENUs导致DNA交联具有一定的序列选择性。
　　 综上所述，本课题分别使用变性电泳、实时荧光和HPLC-ESI-MS/MS方法对CENUs导致的DNA股间交联进行了检测。变性电泳方法作为一种定性分析的方法，重复性好、操作步骤相对比较简单，但是由于灵敏度低，不能满足交联率较低的样品分析，故不适用于定量分析。实时荧光方法灵敏度高、分析速度快，因而适用于对交联DNA双链的定量分析。HPLC-ESI-MS/MS方法检测交联不仅灵敏度和准确性高，而且与实时荧光方法相比，它检测的是交联碱基对dG-dC而不是交联的DNA双链。因此，HPLC-ESI-MS/MS方法更能从本质上揭示交联率的变化规律，同时比实时荧光方法具有更高的稳定性和重复性。HPLC-ESI-MS/MS方法得出的交联率进一步表明，在交联反应的初期明显存在一段交联率上升缓慢的诱导期，这不仅为阐明交联机理提供了依据，同时为进一步探讨交联反应动力学提供了可靠的方法。

目录

文摘

英文文摘

第1章 绪 论

1.1 研究背景

1.2 氯乙基亚硝基脲类药物

1.2.1 亚硝基脲的基本结构

1.2.2 氯乙基亚硝基脲的基本结构和性质

1.2.3 氯乙基亚硝基脲类抗癌药物

1.3 氯乙基亚硝基脲类药物的作用机理

1.3.1 氯乙基亚硝基脲的分解机制

1.3.2 氯乙基亚硝基脲的烷化和交联作用

1.4 DNA交联的检测方法

1.4.1 凝胶电泳

1.4.2 荧光法

1.4.3 高效液相色谱-质谱联用技术

1.5 本课题研究内容

第2章 聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测DNA股问交联

2.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳概述

2.1.1 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.1.2 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.2 实验仪器和试剂

2.2.1 实验仪器

2.2.2 实验试剂

2.3 实验方法和步骤

2.3.1 DNA的变性退火

2.3.2 氯乙基亚硝基脲与合成DNA的交联反应

2.3.3 非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳

2.3.4 变性聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳

2.4 实验结果和讨论

2.4.1 核酸染料染色方法的选择

2.4.2 司莫司汀导致DNA股间交联的变性电泳

2.5 本章小结

第3章 实时荧光法检测DNA股间交联

3.1 荧光分析法概述

3.2 实验仪器和试剂

3.2.1 实验仪器

3.2.2 实验试剂

3.3 实验方法和步骤

3.3.1 DNA浓度的标准曲线

3.3.2 DNA变性过程的实时荧光检测

3.3.3 实时荧光定量PCR仪检测药物导致的DNA交联

3.4 实验结果和讨论

3.4.1 DNA浓度的标准曲线

3.4.2 DNA变性过程的实时检测

3.4.3 实时荧光定量PCR仪检测药物导致的DNA交联

3.5 本章小结

第4章 液质联用方法检测DNA股间交联

4.1 高效液相色谱质谱技术概述

4.1.1 高效液相色谱技术

4.1.2 质谱概述

4.1.3 高效液相色谱-电喷雾质谱联用技术的应用

4.2 实验仪器和试剂

4.2.1 实验仪器

4.2.2 实验试剂

4.3 实验方法和步骤

4.3.1 氯乙基亚硝基脲与合成DNA的交联反应

4.3.2 DNA样品的酶解

4.3.3 色谱和质谱条件

4.4 实验结果和讨论

4.4.1 交联产物的定性分析

4.4.2 交联产物的定量分析

4.5 本章小结

结 论

参考文献

攻读硕士期间所发表学术论文

致 谢